● 传染病相关概念

• 病原体：引起人体疾病的生物。
• 细菌和病毒是最著名的病原体
• 真菌、原生动物和寄生虫也会引起疾病：体癣、疟疾、广州管圆线虫病等
• 传染病：病原体可以从一个人传播到另一个人

● 常见的微生物病原菌

病毒的概念和特征

介绍常见病毒及相关疾病

艾滋病毒

• 艾滋病毒是人类免疫缺陷病毒。正是这种病毒会导致获得性免疫缺陷综合症或艾滋病。
• HIV 主要感染人类免疫系统中的重要细胞，例如辅助性 T 细胞（具体来说是 CD4+T 细胞）、巨噬细胞和树突状细胞。
• 艾滋病是艾滋病毒感染的晚期阶段，一个人的免疫系统受到严重破坏，难以抵抗疾病和某些癌症。
• 目前，尚无治愈 HIV 感染的方法。
• HIV 是一种逆转录病毒，其 RNA 基因组被逆转录成双链 DNA，并整合到宿主细胞的 DNA 中。
• HIV 核心颗粒包含其 RNA 基因组的两个副本，每个副本与引物（宿主 tRNA) 和逆转录酶 (RT) 结合。核心颗粒被含有刺突蛋白的包膜包围。
• 辅助蛋白调节病毒体的形成和潜伏期。
• 远古逆转录病毒序列存在于动物基因组中，包括人类基因组。

HIV 基因组和结构

• HIV 由两份正链（可以直接进行翻译）单链 RNA 组成，该 RNA 编码病毒的 9 个基因（但表达的蛋白不止 9 个，如 gag 基因表达的蛋白会被切割成 p17、p24、p7），并被一个由 2,000 个拷贝的病毒蛋白 p24 组成的锥形 衣壳 Caspid 包围。
• 单链 RNA 与核衣壳蛋白、p7 和病毒体发育所需的酶（如逆转录酶、蛋白酶、核糖核酸酶和整合酶）紧密结合。
• 由病毒蛋白 p17 组成的基质围绕衣壳，确保病毒体颗粒的完整性。
• 病毒包膜：取自人体细胞的两层脂肪分子（磷脂）。
• Env编码三聚体帽（3 个糖蛋白 gp120) 和三聚体茎（3 个 gp41)，帽-茎合在一起是 gp160 构成刺突。
• RNA 基因组至少由 7 个结构标志 (LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS 和 INS) 和 9 个基因（gag, pol 和 env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu；有时有第 10 个基因 tev, 它是 tat, env 和 rev 的融合体），编码 19 种蛋白质。
• gag, pol 和 env 包含制造新病毒颗粒的结构蛋白所需的信息。

HIV 的生命周期

1. HIV 与宿主细胞膜融合之后，HIV 病毒体释放到细胞质中。
2. HIV 基因组逆转录成双链 DNA, 并整合入宿主基因组中。
3. DNA 原病毒转录为逆转录病毒 mRNA, 并输出到细胞质进行翻译。
4. 逆转录病毒 RNA 和蛋白质在细胞膜处组装，并与细胞融合，将病毒释放到胞外。

★ HIV-1 生命周期的关键步骤

（1）进入细胞

• ① HIV 通过巨噬细胞和 CD4+T 细胞的表面糖蛋白吸附到靶细胞受体上，然后病毒包膜与细胞膜融合，并释放 HIV 衣壳进入细胞，从而进入巨噬细胞和 CD4+T 细胞；
• ② 进入细胞的过程是三聚体包膜复合物 (gp160 spike，刺突) 与 CD4 和趋化因子受体（通常为 CCR5 或 CXCR4，或者其他相互作用）之间的相互作用开始的。Gp160 spike 包含 CD4 和趋化因子受体的结合域。
• ③ gp120 与整合素 α4β7 结合，激活 LFA-1（下游信号通路）, 这是参与病毒突触建立的主要整合素，可促进 HIV-1 在细胞间的有效传播。
• ④ HIV 与靶细胞结合后，将 HIV RNA 和各种酶（包括逆转录酶、整合酶、核糖核酸酶和蛋白酶）注入细胞中。
• ⑤ HIV 可以通过 CD4-CCR5 途径，或者甘露糖特异性 C 型凝集素受体途径（例如 DC- SIGN) 感染树突状细胞 (DC)。DC 是病毒在性传播过程中遇到的最早的细胞之一。目前认为，当 DC 将粘膜中的病毒捕获时，它们通过将 HIV 传播至 T 细胞发挥重要作用。

（2）HIV 基因组逆转录成双链 DNA

• ① 病毒衣壳进入细胞后不久，逆转录酶从附着的病毒蛋白中释放出单链 (+)RNA 基因组，并将其复制到互补的 DNA (cDNA) 分子中。
• ② 逆转录过程非常容易出错（因为逆转录酶保真度不高），并产生突变，可能导致耐药性或使病毒逃避人体的免疫系统。
• ③ 逆转录酶还具有核糖核酸酶活性，可在合成 cDNA 时降解病毒 RNA；还具有 DNA 依赖的 DNA 聚合酶活性，用于从反义 cDNA 产生有义 DNA。
• ④ cDNA 及其互补序列共同形成病毒的双链 DNA, 然后沿着微管将其转运到细胞核中。由病毒的整合酶将病毒 DNA 整合到宿主细胞的基因组中。

● 逆转录过程

• ① 特定的细胞 tRNA 充当引物，并与病毒基因组的引物结合位点 PBS 结合；
• ② 合成互补 DNA 并结合到病毒 RNA 的 R 区 (RNA 分子两端重复）和 U5（非编码区）；
• ③ 逆转录酶上称为 RNAse H 的结构域可降解 RNA 的 5'末端，从而去除 R 和 U5 区域；
• ④ 然后，引物"跳"至病毒基因组的 3'端，其中新合成的 DNA 链与 RNA 上的互补 R 区杂交；
• ⑤ 互补 DNA (cDNA) 的第一链被延长，大部分病毒 RNA 被 RNAse H 降解；
• ⑥ 链完成后，从病毒 RNA 开始第二链合成；
• ⑦ 然后是另一个“跳跃”，第二条链中的 PBS 与第一条链 上的互补 PBS 杂交；
• ⑧ 两条链都进一步延伸，可以通过整合酶整合到宿主基因组中。

（3）复制和转录

• ① 然后，在 HIV 感染的潜伏期中，这种整合的病毒 DNA 可能处于休眠状态。为了主动产生该病毒，需要存在某些细胞转录因子，其中最重要的是 NF-κB (NFκB) 。当 T 细胞被激活时（发生其他感染时），分泌NFκB，病毒开始复制。这意味着最有可能被 HIV 杀死的细胞是那些目前正在抵抗感染的细胞。
• ② 在病毒复制过程中，整合的 DNA 原病毒被转录成 mRNA, mRNA 被剪成较小的片段，这些小片段从细胞核输出到细胞质，然后在细胞质中翻译为调节蛋白 Tat（可鼓励新病毒的产生）和 Rev。
• ③ 随着新产生的 Rev 蛋白入核，在细胞核中积累，它与病毒 mRNA 结合并允许未剪接的 RNA 离开核，否则它们会保留在那里直到剪接。
• ④ 在这一阶段，结构蛋白 Gag 和 Env 由全长 mRNA 产生。全长 RNA 实际上是病毒基因组，它与 Gag 蛋白结合，并被包装成新病毒颗粒。

（4）病毒装配和释放

• ① 病毒循环的最后一步是组装新的 HIV-1 病毒，开始于宿主细胞的质膜。Env 聚合蛋白 (gp160) 穿过内质网，并被转运到高尔基体，在高尔基体中被蛋白酶切割并加工成两种 HIV 包膜糖蛋白 gp41 和 gp120。
• ② 糖蛋白被转运到宿主细胞的质膜，在此 gp41 将 gp120 锚定到被感染细胞的膜上。Gag(p55) 和 Gag-Pol(p160) 多聚蛋白与质膜的内表面以及 HIV 基因组 RNA 结合，病毒粒子开始从宿主细胞中出芽。
• ③ 成熟可能发生在形成芽中，也可能发生在从宿主细胞中出芽的未成熟病毒体中。在成熟过程中，HIV 蛋白酶将多聚蛋白裂解为单独的功能性 HIV 蛋白和酶。
• ④ 然后组装各种结构成分以产生成熟的 HIV 病毒粒子。该切割步骤可被蛋白酶抑制剂抑制。然后，成熟的病毒能够感染另一个细胞。

● 艾滋病毒减轻宿主的免疫反应

• HIV 粒子表面的 gp120 蛋白脱落， 与正常细胞膜上 CD4 受体结合，使该细胞被免疫系统误认为病毒感染细胞而遭杀灭（CD4 细胞减少）。
• 因 T 细胞 CD4 受体被 gp120 封闭， 影响了其免疫辅助功能。
• HIV 的 gp120 蛋白可刺激机体产生抗 CD4 结合部位的特异性抗体，阻断 T 细胞功能。
• 带有病毒包膜蛋白的细胞可与其他细胞融合形成多核巨细胞而而丧失功能。

HIV 治疗

• HAART（鸡尾酒疗法）: 基于蛋白酶抑制剂的治疗自 1996 年以来开始可用。通常是两种核苷类似物逆转录酶抑制剂 (NARTI 或 NRTI) 加上蛋白酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂。(抑制病毒逆转录的过程，使病毒 RNA 不能整合到基因组中，不能逆转录，但仍在低水平复制。）
• HAART 不能治愈患者，也不能统一消除所有症状；如果停止治疗，高水平的 HIV-1 病毒（通常具有 HAART 耐药性）会复发。
• 改善当前治疗方法的研究包括降低当前药物的副作用，进一步简化药物治疗方案以改善依从性，以及确定治疗耐药性的最佳治疗方案顺序。
• 但是，经过 20 多年的研究，HIV-1 仍然是疫苗的目标。

流感病毒

• 流行性感冒病毒导致周期性的呼吸道疾病大流行。
• RNA 病毒，(-)ssRNA
• 根据病毒表面上出现的两种蛋白质（刺突）（血凝素 H1 至 H18 和神经氨酸酶 N1 至 N10) 的特定种类和组合的亚型。
• 新的强毒株通过人和禽株的重组产生。

● 人类中传播的甲型流感病毒亚型

• H1N1 引起西班牙流感和 2009 年猪流感爆发
• H2N2 在 1950 年代末引起了“亚洲流感”
• 1960 年代末， H3N2 引起了“香港流感"
• H5N1 在 2000 年代中期蔓延，被认为是全球流感大流行的威胁
• H7N7 具有不寻常的人畜共患病潜力
• H1N2 目前在人和猪中流行
• H9N2，H7N2，H7N3, H5N2 和 H10N7。

● 核心颗粒：：RNA，衣壳蛋白，基质蛋白，包含刺突蛋白的包膜

● 流感病毒的生命周期

• 流感病毒由分段的 (-) 链 RNA 组成。每个片段都包装有核衣壳蛋白。来自不同菌株的片段通过共感染重组。
• 衣壳蛋白和基质蛋白封闭了流感病毒的 RNA 片段。基质被包含刺突蛋白的包膜包围。
• 包膜蛋白介导病毒的附着。包膜蛋白包括融合肽，该融合肽通过构象变化以引起病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合。对于流行性感冒，病毒体通过内吞作用而被内在化。
• 溶酶体与内吞体 (endosome) 的融合触发病毒包膜与内吞体的融合。然后，病毒基因组和蛋白质被释放到细胞质中。病毒 (-) 链 RNA 片段未被包被并进入细胞核。
• 来自宿主 mRNA 切割后产生的带帽 RNA 片段引发流感 mRNA 的合成。病毒 mRNA 返回细胞质进行翻译。
• 基因组 RNA 合成由核衣壳蛋白 (NP) 引发。首先，将 (+) 链 RNA 合成为 (-) RNA 链的模板，然后将其包装在新合成的核衣壳蛋白中并输出到细胞质中。
• 流感病毒的包膜蛋白在 ER 处合成，然后转运到细胞膜上。
• 流感病毒在细胞膜上组装，衣壳、基质和 (-) 链 RNA 成分被包装在包膜中。

严重急性呼吸系统综合症 SARS

● 体征和症状

• 最初的症状类似于流感，可能包括发烧、肌痛、嗜睡症状、咳嗽、喉咙痛和其他非特异性症状。
• 高于 38°C (100°F) 的发烧。
• 稍后可能会出现呼吸急促。
• 患者在第一阶段有感冒症状，但后来又像流感。

● 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒：SARS-CoV

• 正链 (+) ssRNA 病毒
• 基因组：27-30 kb, 14 个 ORF
• 三种糖蛋白：S (E2) ，M (E1) 和 HE （血凝素酯酶）
• S: S1 （与受体 ACE2 绑定）和 S2 （介导膜合并）
• 直径 80- 160 nm

新冠肺炎病毒 COVID-19

● 目前感染人数已经超过 1.63 亿，累计死亡人数超过 337 万。 ● 起源未知。 ● 症状：

• 发热
• 咳嗽
• 呼吸急促或呼吸困难
• 寒意
• 反复颤抖发抖
• 肌肉疼痛
• 头痛
• 咽喉痛
• 新的味觉或气味损失

● 序列：Complete Genome Sequence of a 2019 Novel Coronavirus (SARS -CoV- 2) Strain Isolated in Nepal

冠状病毒

● 结构：

• 结构蛋白：Spike、Envelope、Membrane、Nucleocapsid protein
• 非结构蛋白

● 人冠状病毒生活周期图 图源：Human Coronavirus: Host-Pathogen Interaction

生物病毒的应用

1. 噬菌体（杀菌）可以作为防治某些疾病的特效药，例如烧伤病人在患处涂抹绿脓杆菌珀菌体稀释液。
2. 在细胞工程中，某些病毒可以作为细胞融合的助融剂（细胞之间有接触抑制的特性，有病毒存在时会发生融合），例如仙台病毒。
3. 在基因工程中，病毒可以作为目的基因的载体，使之被拼接在目标细胞的染色体上。
4. 在专一的细菌培养基中添加的病毒可以除杂。
5. 病毒可以作为精确制导药物的载体。
6. 病毒可以作为特效杀虫剂。
7. 病毒还在生物圈的物质循环和能量交流中起到关键作用。
8. 病毒还可以用来治疗疾病，比如癌症。

• 基因转移载体是由病毒制成的。
• 删除毒力基因，并插入来自其他病毒的有效启动子序列。
• 为了提高载体的生物安全性，将病毒载体进化为把包装和生产所需的病毒序列与编码病毒蛋白的序列分开的形式。

● 常见病毒表达载体

• 慢病毒载体 (Lenti Virus)
• 腺病毒载体（AV)
• 腺相关病毒载体 (adenovirus associated virus，AAV)
• 逆转录载体 (RV)

● 腺病毒载体环化并与宿主基因组分开复制。 ● 逆转录病毒、慢病毒载体整合在宿主基因组内。 ● 基因载体安全性：腺相关病毒：RG1 > 腺病毒：RG1 > 慢病毒：RG2 > 逆转录病毒：RG3

• 源自人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的慢病毒载体；
• 用于哺乳动物细胞（分裂和非分裂细胞）的基因表达，会整合到基因组。
• HIV-1 基因组含有 9 个开放阅读框，编码至少 15 种与感染周期有关的不同蛋白质，包括结构蛋白和调节蛋白。
• 基因组上具有一些顺式作用元件，包括长末端重复序列 (LTRs)、TAT 激活区 (TAR)、剪接供体和受体位点、包装和二聚化信号（ψ）、Rev 反应元件 (RRE) 以及中央和末端多聚嘌呤区 (PPT), 用于不同病毒生命周期的各个阶段基因表达的需要。

● 第一代慢病毒载体

• 载体组分（3 质粒）: (i) 包装质粒 Packaging plasmid； (ii) 编码病毒糖蛋白的 Env 质粒（包膜质粒 Env encoding plasmid）：VSV-G; (iii) 转移质粒 Vector plasmid。
• 利用基因工程手段特异性删除包装质粒的包装信号（提高安全性）或 LTRs，减少复制型感染性慢病毒 (RCLs) 的产生。

● 第二代慢病毒载体 修饰系统中的 4 个辅助蛋白编码基因 (Vif, Vpu, Vpr 和 Nef): 即删去第一代慢病毒载体包装质粒中 HIV 的所有附属基因，这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和转染能力，同时增加了载体的安全性。

★ 第三代慢病毒载体（现用）

• 载体组分 (4 质粒） (i) 2 个包装质粒，一个编码 Rev 和一个编码 Gag 和 Pol； (ii) 编码病毒糖蛋白的 Env 质粒（包膜质粒）； (iii) 转移质粒。
• 生物安全性进一步提高：减少了复制型感染性慢病毒（RCLs）的产生 ① 通过将载体质粒 5’LTR 的 U3 启动子区替换为来自 CMV 或 RSV 的强病毒启动子构建 tat 非依赖性的质粒 ； ② 载体质粒 3’LTR 的 U3 区序列缺失确保了慢病毒颗粒在转导、整合到靶细胞的基因组 DNA 中后自我失活（不再具有侵染能力，即只能侵染一次）； ③ 包装、复制和转导所需的慢病毒基因数减少到三个 (gag, pol, rev)； ④ 与 Mulv 逆转录病毒载体相比，慢病毒载体更倾向于整合到宿主基因组的活性转录区域中，其激活原癌基因沉默的风险低于 Mulv 逆转录病毒载体。

• 腺相关病毒是一类单链线状 DNA 缺陷型病毒。
• 基因组 DNA 小于 5 kb，无包膜，外形为裸露的 20 面体颗粒。
• AAV 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染。

● 腺相关病毒基因组

• 基因组两端为末端反向重复序列 (ITR)，中间基因组编码两个蛋白︰Rep 和 Cap。 ITRs 对于病毒的复制和包装具有决定性作用。 Cap 蛋白为病毒衣壳蛋白 Rep 蛋白参与病毒的复制和整合

• AAV 能感染多种细胞。Rep 蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第 19 号染色体的特异位点：AAVS1 位点。这是已知的唯一能够 定点整合 的哺乳动物 DNA 病毒。

• 野生型 AAV-2 基因组图 (A) Rep 和 Cap 基因两侧是 ITR。不同的 Rep 和 Cap 转录物是由它们各自的启动子 (P5, P19 和 P40) 产生的。星号表示用于生产 VP3 的替代 ACG 密码子。 (B) AAV-2 ITR 的二级结构，显示了 RBE (Rep binding element, GAGCGAGCGAGCGCGC; RBE’，CTTG) 和 TRS ( terminal resolution site 末端解析位点，GTTGG)。ITR 对于 AAV DNA 复制很重要。

● AAV 的生命周期

• 在腺病毒共感染的情况下，AAV 具有感染性：基因组复制、病毒基因表达和产生病毒体。
• 在没有腺病毒的情况下，AAV 可以通过整合到 19 号染色体 (AAVS1) 中来建立潜伏期。
• 潜伏的 AAV 基因组可以通过腺病毒的超感染恢复复制。
• AAV 生命周期的两个阶段都受到 AAV 基因组与 AAV ，腺病毒和宿主蛋白之间复杂相互作用的调节。

腺相关病毒载体

a. AAV 的示意图。单链基因组被蛋白质衣壳包围。 b. AAV 的 DNA 基因组。编码 rep, cap 和 aap 开放阅读框的 4.7 kb 基因组的两端是 ITR。 c. AAV 载体的组分。 ① 将治疗性转基因以及相关的启动子和聚腺苷酸化序列（polyA） 插入病毒 ITR 之间。 ② 载体表达 AAV rep 和 cap ③ 载体表达腺病毒 E2A, E4 和 VA RNA 缩写：AAP, 组装激活蛋白；AAV, 腺相关病毒；ITR，反向终端重复；PolyA, 聚腺苷酸化序列；VA, 病毒相关。

● 腺相关病毒载体的优点

• 腺相关病毒载体 AAV Helper-Free System, 不需要腺病毒辅助载体的包装系统。
• 重组腺相关病毒载体 (rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

● 腺相关病毒载体的缺点

• AAV 载体容量小，目前最多只能容纳 4.7kb 外源 DNA 片段；
• 野生型的 AAV 在 40% - 80% 的成人中存在过感染，不利于疫苗的产生；在腺病毒存在的情况下可能会引起免疫排斥。

● AAV 适合表达的基因

1. 治疗基因的长度不能过大。AAV 的总容量 4.7kb, 还要包括 AAV 自身的 ITR，启动区和 RNA 加尾信号；
2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；
3. 长期表达目的基因，没毒副作用；
4. 不需要目的基因立刻表达；
5. 不需要基因高水平表达（基于病毒的表达载体，表达量都会低一些）；
6. AAV 载体对靶细胞具有较高的转导效率。

单纯疱疹病毒 HSV : DNA 病毒

• 单纯疱疹病毒会导致口腔或生殖器粘膜的疮口反复发作的病毒。最初的传播是通过口腔或生殖器接触，然后是神经节神经元中潜伏的重新激活的病毒爆发。
• 疱疹病毒粒子包含一个双链 DNA 基因组，包装在二十面体衣壳中。衣壳被许多基质蛋白和被膜包围。
• HSV 附着可能涉及多种受体。
• 微管支架将疱疹病毒粒子运输到细胞核，并插入 DNA 基因组。HSV 组装发生在核膜或其他膜上。病毒粒子通过胞吐作用从细胞释放，快速释放导致粘膜病理。
• HSV 的 DNA 基因组通过滚圆法合成（复制效率高），使用病毒 DNA 聚合酶并辅以病毒和宿主产生的成分。
• 感染性 mRNA 表达导致衣壳蛋白，基质蛋白和包膜蛋白的产生，从而组装 HSV。
• LAT 蛋白的表达通常在神经细胞中导致潜伏感染，在该细胞中，DNA 沉默持续数月或数年。

单纯疱疹病毒载体

● 扩增子系统包括：

1. 扩增子质粒，其包含 DNA 复制 (Ori) 的单纯疱疹病毒 (HSV) 起源，HSV 包装序列 (Pac)，抗生素抗性基因 (Amp) 和启动子-转基因盒；
2. 辅助病毒 以提供病毒复制功能。

● 删除了包装信号的辅助病毒基因组被克隆到细菌人工染色体 (BAC) 中。 ● 当真核细胞与扩增子和 HSV-BAC DNA 共转染时，所得病毒颗粒只能识别和包装扩增子质粒，从而产生无辅助病毒的扩增子储备。

作业：查找 SARS-CoV2 的 S 蛋白（分泌到胞外）的核酸序列，并把它构建到真核表达载体中，让它分泌表达在细胞外。要求设计引物，描述设计方案。 分泌到胞外：给 S 蛋白融合一段分泌肽，放在分泌肽后，且同框。