涉及植物研究的朋友应该了解真菌植物共生，根瘤菌和大豆共生是教科书级别的经典案例。作为农业生产中重要的共生关系，植物与真菌的共生一直是农业科研人员的研究热点。由于自然环境中的植物具有本能的防御能力，这对共生真菌的寄生造成了极大的障碍。因此，人工介导的真菌感染寄主植物产生共生技术。
早在1985年，一些研究人员就将菌丝放入分生组织的切口中，以实现真菌对植物的感染。近年来，该方法已广泛应用于分子水平的真菌植物共生研究。然而，目前还没有评估疫苗接种后早期真菌感染反应的综合计划。最近，新西兰北帕默斯顿草原研究中心Damien J. Fleetwood团队以“Histological Methods to Detect Early-stage Plant Defense Responses during Artificial Inoculation of Lolium perenne with Epichlo? festucae题目发表在Bio-Protocol最新研究表明，真菌感染植物有四种重要反应，包括细胞死亡、老茧沉积、木质素产生和过氧化氢 (H2O2) 产生这些生理指标对于在非常早期的时间点确定宿主对感染的反应非常有用。
简单地说，植物的早期行动之一是产生不同类型的活性氧，以应对入侵的微生物 (ROS)，其中H2O2，它是保护植物免受入侵微生物侵害的最早信号之一，并诱导植物的其他反应[1]。此外，植物在感染部位重塑细胞壁，防止真菌入侵[2-3]。感染部位周围的植物细胞作为晚期防御反应，会经历程序性细胞死亡(过敏反应)，以限制入侵微生物的可用食物[4]。因此，我们只需要检测这四个生理指标，就可以知道真菌是否成功地感染了寄主植物。
第一步，胼胝质沉积的染色，作者采用苯胺蓝染色方法[5]。这是一种经典而快速的方法，只需准备适合苯胺蓝染色液浓度，室温染色约30种 min，可用荧光显微镜观察，一般根据荧光强度的强度来判断老茧沉积量。本文涉及的染色试验均为7岁幼苗接种，接种后4天染色，对照组设置切口植物和未切口植物。首先，在幼苗接种后4天进行老茧染色，染色结果如图所示，A图中空白对照组未检测到荧光，Impatiens walleriana花粉管性对照，花粉管可以检测到强黄绿色荧光，B图中对照组也没有检测到荧光，实验组检测到强黄绿色荧光。黄绿色荧光的强度表示菌株是否成功感染寄主植物。
图1. 染色沉积色
第二步是对木质素沉积的染色。作者采用番红素溶液染色法。染色结果见图2。番茄红染料不能染色未切口的植物，但可以染色切口的植物。实验组接种突变体菌株和野生菌株的植物染色较深，即产生大量木质素，以确定植物接种成功。
图2. 染色木质素沉积
第三步是观察死细胞。作者采用了台潘蓝染色法。染色结果见图3。接种野生菌株或突变体菌株的植物呈大面积深蓝色。植物细胞的死亡程度可以通过台潘蓝染色的深度来判断，植物是否成功接种。
图3. 台盼蓝染色
第四步，H2O2染色，最常用的是DAB染色法。该方法基于可视化3，3'-二氨基联苯胺(DAB)被H2O2氧化后的颜色变化，染色结果见图4。实验组接种突变体菌株的植物比接种野生菌株的植物产生更多的黑棕色沉淀。DAB染色判断植物体内染色的深度H2O2同时，确定菌株是否成功接种植物。
图4. H2O2染色
实 验 Tips
1. 为了保证实验的准确性，每种处理条件下的植物至少有5种生物重复。
2. 由于植物，生理指标的染色试验应采取措施。染色时间可能因植物或不同部位的组织而异Protocol不能取得好成绩时，要考虑染色条件是否适当调整。
3. 染色的植物组织需要在显微镜下观察。为了确保照片更接近实际情况，有必要不断调整显微镜的光强和曝光时间，以达到最佳效果。
4. 这四个生理指标并不局限于这个实验，可以在许多实验中使用。例如，生物胁迫或非生物胁迫导H2O2当你想判断植物生长是否正常时，试试H2O2染色就知道了。再比如拟南芥在低磷胁迫下，主根生长受到严重抑制，此时根尖H2O2，所有的老茧都有大量的沉积物。因此，小伙伴们看事情不要太局限哦，实验也是一通百通。
参考文献
[1] Walters, D. R. (2003). Polyamines and plant disease. Phytochemistry 64(1): 97-107.
[2] Luna, E., Pastor, V., Robert, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. and Ton, J. (2011). Callose deposition: a multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe Interact 24(2): 183-193.
[3] Zipfel, C. (2009). Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Curr Opin Plant Biol 12(4): 414-420.
[4] Lo Presti, L., Lanver, D., Schweizer, G., Tanaka, S., Liang, L., Tollot, M., Zuccaro, A., Reissmann, S. and Kahmann, R. (2015). Fungal effectors and plant susceptibility. Annu Rev Plant Biol 66: 513-545.
[5] Knox, R. B. (1979). Pollen and allergy. Studies in Biology. No. 107. Arnold, London.
Bio-protocol 简介
Bio-protocol斯坦福大学成立于2011年， 致力于搭建全球权威、优质的生物实验方案共享平台，帮助科学发现。Bio-protocol期刊是Bio-protocol同行评审的国际学术期刊发表了高质量的生命科学实验计划，旨在提高科研的可重复性。到目前为止，Bio-protocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的近4000篇实验方案，并且同Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收录。
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