荧光成像（FI，Fluorescence Imaging）它是生物医学中最流行的成像模式之一。 其优点包括：

1. 高对比度，即信噪比（SNR）：由于使用不同的波长分别用于照明和记录（见图4），只有目标可见，背景不可见；
2. 高灵敏度:即使浓度很小也能看到；
3. 给出分子层级的信息：使一些组织的（生物）化学信息在空间和时间上可见;
4. 它是一种优越的研究工具：有多种成像方法，大多数是独立的；
5. 便宜：所需的光学仪器非常简单，数据处理规模和计算消耗不大；
6. 易用：类似经典染色。

以吲哚菁绿（ICG）荧光成像是一种相对新颖的成像方法，因此仍在以多种方式发展。ICG在一些临床应用中已经使用了近60年，其在相关领域的应用是众所周知的，极大地促进了其新应用的引入。 从工程的角度来看，图像和视频处理似乎是ICG成像（ICGI）用于分析最具发展潜力的领域之一icg荧光动力学(见图2)。 这意味着，对于推动各种新兴的基于icg在临床实践中，仍有大量的计算开发工作要做。

几十年来，视网膜血管造影中使用了炎炎绿。然而，荧光素在视网膜血管造影中更受欢迎，很大程度上是因为它在没有任何电子相机的情况下可见。 然而，荧光素和icg在视网膜层上成像的对象有些不同。ICG由于它在近红外提供了关于深静脉的信息（NIR）在近红外工作（NIR）中等生物组织比可见光波长更透明。

见论文

大多数关于ICG研究似乎与临床科学有关，而不是工程、光学、光谱或成像，这表明ICG在许多领域都有很大的发展空间。 例如，大多数图像处理只涉及视网膜ICGA。ICG视网膜成像等一些长期和常规的临床应用为我们提供了许多有价值的知识和经验，可以用来开发新的临床应用。预计这些应用会很快引入 同时，风险和成本相对较低。

在水溶液中，ICG分子倾向于聚集，影响其光学性质。 因此，聚集取决于浓度和时间；ICG解决方案不遵循Lambert-Beer定律高于15 mg / L的血浆。 当ICG在蒸馏水中溶解时，光谱稳定性最快，因此当快速光谱稳定性非常重要时，例如，当ICG当用于定量目的时，Landsman等人。等渗盐水和/或白蛋白不建议添加到注射液中。 在组织和细胞中，由于与细胞蛋白的结合，NIR吸收峰移动到更长的波长(810nm）。

当受到激发时，ICG会产生单线态氧，这是一种强的细胞毒性物质。恩格尔等人。最近研究了暴露在光线下icg的稳定性以及icg单线态氧产生的后果。根据他们的观察，icg的分解是由于单线态氧，但似乎单线态氧立即与icg本身的分解产物结合。因此，似乎icg不是单线态氧的非常好的来源。这对临床应用有两个主要的影响：首先，可以使用icg而不必担心由于单线态氧产生的光毒性;其次，当icg用作光动力或光热剂时，其分解产物可能是光毒性的主要原因。分解产物进一步热分解成几种羰基化合物。然而，根据tokuda等人最近的一项研究，icg似乎对视网膜有些光毒性。 恩格尔等人测试了几种溶剂，用于光诱导的icg分解。 血管造影应用的另一个有趣和令人鼓舞的是，发现血浆中的icg会分解，因此与水中的icg相比，只记录了少量的分解产物。 他们认为产生的单线态氧被一些血浆蛋白淬灭，从而抑制了单线态氧的icg分解。 最近佐藤等人。通过对培养的Muller细胞进行长波长滤波，研究了宽带光对ICG毒性的影响。根据他们的观察，过滤可以防止光毒性。

与血浆蛋白特别是脂蛋白快速结合的重要特性使ICG在手术中的重复应用成为可能。与血浆蛋白的结合似乎不会改变蛋白质结构，这是无毒性的一个标志。似乎ICG实际上与脂蛋白复合物（β-脂蛋白）的脂质结合，这种结合比ICG结合自由胆固醇产生更强烈的荧光。与血液蛋白质的结合也会缓慢地移动几分钟，吸收峰值在780 nm处向更长的波长移动到805 nm。 在表皮细胞培养物中在810nm观察到最大吸收峰，在体内人体皮肤中观察到805-810nm处的吸收峰最大值。 发射峰也同样地移动。 光谱的形状和荧光寿命的变化都会受到化学环境的影响，这一事实可用于探测ICG和类似染料的分子环境。

icg没有任何已知的代谢产物，它被肝脏快速提取到胆汁中。 通过称为谷胱甘肽s-转移酶的蛋白质进行转运而不进行修饰。 在低剂量（0.5mg / kg）下，热量限制似乎显着增加血浆清除率。 不同肝脏疾病的蛋白质谱也影响血液中的icg蛋白结合。 reekers等。 提供了最近对身体状况i-ii患者的血浆消失率的研究。 用于体内视网膜和脉络膜血管造影的典型染料浓度在通过注射到外周臂静脉中施用的20-25mg / ml icg的范围内。 对于肝功能的研究，静脉注射剂量基于0.5mg / kg体重计算。 在心输出量和血容量监测中，注射的染料总剂量应保持在2 mg / kg以下。 在高剂量5mg / kg体重的人中未观察到显着的毒性作用。 表3简要概述了使用icg进行的毒性研究。

ICG在所谓的组织光学窗口中工作，即，在激发和荧光中使用的NIR光穿透组织几毫米甚至更远。 这种半透明性有助于观察，例如，可能埋在凝块或硬脑膜中的血管结构。光能进入皮肤和下层组织的渗透深度可以根据光密度od的体内测量来计算（会计散射和吸收） ）定义为od = log10i0 / it的人体皮肤和下层组织，其中i0是测量的背反射强度，它是参考的反射强度。 在775,807和827nm对12名健康年轻受试者进行的这种测量给出了3mm皮下脂肪层的以下依赖性：od775 = 3.2; od807 = 2.4; od827 = 1.6。 低吸收和高散射允许由于光子再循环效应而提供对皮肤组织的平滑且强烈的深度照射。

虽然近红外荧光（NIRF）成像具有公认的潜力，但只有ICG是临床认可的NIRF染料。 也许在未来会有更多的NIRF染料。 至少在开发新的NIRF染料方面的工作一直在进行，并且已经引入了几种潜在的nirf染料候选物。 在这里，我们将简要回顾一下icg衍生品的最新发展。 虽然icg与血液中的脂蛋白迅速结合，但将icg与脂蛋白纳米粒子结合是很自然的[66]。 脂质纳米颗粒和胶束已掺杂有icg。 ogawa等。 已经将icg与几种抗体结合，以便将icg靶向癌细胞。 然而，与蛋白质结合的icg通常显着地失去其荧光。 因此，为了具有高荧光效率，应该解离icg-抗体复合物，使得icg可以用作体内分子成像探针。秒。 achilefu的小组最近将icg与叶酸 - 聚乙二醇结合用于肿瘤靶向。 艾伯特等人。 他们将icg的药代动力学与其称为sidag的亲水衍生物与用于乳腺癌成像的小鼠模型进行了比较。 已经使用icg实现了几个封装。 makino等。 用icg标记了乳糖体。 发现标记的乳糖体在血液循环中是稳定的并且在小鼠模型肝肿瘤部位逐渐累积。 巴特等人。 已经设计了磷酸钙钙复合纳米粒子嵌入icg用于靶向人类乳腺癌和胰腺癌。 次氰酸绿（ifcg）（法国巴黎的laboratoires serb）也称为ifc绿，是不含碘的icg。据认为，IFCG在黄斑应用中的细胞毒性较小，因为5%的葡萄糖溶液代替纯水作为其溶剂。根据[56]，IFCG对视网膜细胞的毒性小于ICG的10倍。次青绿用于黄斑皱褶手术的研究。在[82]中比较了商用ICG和IFCG产品在几种溶剂和浓度下的吸收和发射光谱。

在本节中，将给出从仪器工程角度对icg成像的概述。 吲哚菁绿成像属于光学荧光成像类。 相应地，当与手术显微镜一起使用时，它非常类似于荧光显微镜。 因此，所需的仪器与一般的荧光成像或特别是荧光显微镜相似或甚至完全相同。

通常，荧光显微镜是这样做的：可见光或激发光和荧光图像一起显示为一个图像。 单独的荧光图像可以仅包含一些细节，因此可见图像借助于在可见图像中看到的界标有助于定位荧光部分的位置。 通常，荧光通道以鲜艳的绿色显示和呈现，与组织的可见图像具有鲜明的颜色对比。 这种可视化在术中使用中尤为重要，其中荧光部分如血管应该容易且立即被识别。 为了能够组合这两个图像，它们应该被正确地对准，这被称为图像配准，并且它通常是计算上硬的图像处理操作，而用于显示的两个图像的渲染是简单的操作。 然而，使用普通分束器的光学装置可以完全避免图像配准问题，该分束器是二向色分光镜并将光束分离、过滤为两部分：一部分用于可见摄像机，另一部分用于近红外摄像机。这意味着两个摄像机看到完全相同的视野（fov），并且不需要注册，前提是摄像机具有相同的光学系统并且相对于彼此正确定位。除了分束器之外，嵌入在光学器件中或在单独的滤光片立方体中的合适的可更换滤光器（这是荧光显微镜中通常的布置）被用在相机前面以阻挡不需要的波长进入传感器。对于近红外相机来说，滤光器尤为重要，它使得激发光不与荧光信号混合，因为两者在传感器处相加在所得电子图像中是不可分离的。可见光范围内的相机通常已经包含阻挡大部分近红外辐射的滤光器，否则这些滤光器将在不同程度上与视觉图像的不同RGB通道相加，从而扭曲其感知颜色。传统荧光显微镜和使用分束器进行ICG荧光成像的操作显微镜之间的主要区别在于，荧光显微镜中通过分束器完成的照明被普通彩色相机取代，而照明可以通过外部光源完成。激发光不应含有荧光波长，它们应仅来自发荧光的ICG。因此，当使用广谱光源时，需要滤光器来阻挡来自发射的激发光的更长波长。理想情况下，两个滤波器应将频谱划分为两个非重叠频段（图3）。这可以使用干涉滤光器对来完成，干涉滤光器对可以针对任何波长范围进行定制，并且可以具有非常窄的过渡带。商用干涉滤光片对也可用于icg荧光，将光谱分离到约800 nm（色度技术，brattleboro，vt，usa）（见图3）。当使用具有窄光谱的光源，激光器时，不需要使用任何激发光滤光器。分束器的使用是解决具有挑战性的图像配准问题的一种特别简单和实用的方法，它可以使彩色图像和ICGA的说明性混合易于在线完成，这对于关键的术中使用至关重要。（表4）。

表6描述了可用于荧光成像的光源的基本特性。 正如我们在表5中看到的，所有基本光源类型已经在一些现有的ICGA实现中使用。 最常见的是LED和卤素灯用于照明。 在一些实验中，还使用了激光器，主要是半导体二极管激光器，类似于LED。 在这个例子中，我们将仔细观察LED。 LED灯不是完全单色的，而是包含通常具有钟形光谱的波长（图3），它不应与相机滤光片光谱（fc）重叠太多（图3）。如果记录或观察到视觉图像，我们自然需要白光源。 请注意，大多数显微镜灯至少部分地滤除了NIR波长。 图3显示了标称（峰值）波长为780nm的led的光谱（led 780-66-60，roithner lasertechnik gmbh，vienna，austria）。 用hr4000分光光度计（ocean optics，dunedin，fl，usa）进行测量。 可以看出，波长范围超过100纳米，带宽为30纳米（fwhm）。

原则上，每个ccd或cmos相机都能记录nir。但是，大多数相机都是通过切割nir波长的滤镜来防止这样做的，否则叠加的nir图像会严重干扰视觉图像。相机传感器最重要的参数是分辨率，信噪比（snr）和量子效率。影响snr的参数是adc转换器的分辨率，读取噪声，暗电流和传感器的量子阱深度。表7和表8中列出了一些选定传感器的这些参数：mt9p031和mt9v032（aptina imaging，san jose，ca，usa）是典型的互补金属氧化物半导体（cmos）传感器，不同之处在于增强了后者的nir响应。机器视觉相机，elphel nc353l（elphel inc。西谷市，犹他州，美国）包括mt9p031传感器。 kai-11002（柯达，纽约，美国）是典型的电荷耦合器件（ccd）传感器。 ixon3和neo传感器（andor technology plc，belfast，北爱尔兰）适用于需要高灵敏度的科学成像。 ixon3基于电子倍增器ccd（em-ccd）技术，而neo基于科学cmos（scmos）传感器。 fl-280和er-150是来自hamamatsu（hamamatsu photonics k.k，shizuoka，japan）的相应的scmos和ccd传感器。 虽然几乎所有的硅基相机对近红外都有些敏感，但当它们没有阻挡nir波长的滤波器时，不幸的是，量子效率往往会通过增加波长而迅速减小（图5）。在设计icg成像时，这种量子效率的降低是一个必不可少的问题，因为荧光峰非常宽并且远远超过800nm，效率非常低。因此，光源和滤光片的标称波长应尽可能短，这与激发和荧光的良好分离以及icg的吸收最大值应接近激发光的标称波长这一事实相矛盾。资源。 icg的量子效率很低，在水中约为0.3％，在血液中约为1.2％。这限制了相机灵敏度，尤其是在视频应用中。冷却的ccds通常用于增加信噪比（参见表5）。有时，图像增强器（夜视）用于增加视频记录的灵敏度，并允许低剂量的icg（微剂量）。

我们已经回顾了200多篇论文，描述了荧光造影剂吲哚青绿在临床上的开发和应用，主要是手术，应用。 由于空间限制，许多有趣的作品不得不省略。 然而，希望我们成功地收集了大部分主要出版物，概述了吲哚菁绿荧光技术及其最重要的新兴临床应用。 ICG和ICG血管造影的许多新的临床应用刚刚出现，并且肯定会在不久的将来出现更多; 因此，显然还需要更多的研究才能充分发挥这种相对简单的光学技术的所有潜力。 进一步工程研究的明显领域包括 （i）ICG和ICGA信息的图像处理，也包括实时的（视频和立体声）， （ii）毛细血管循环监测和灌注动力学成像， （iii）将ICG和其他成像方式结合，如可见光，ct，mri和宠物[263-266]， （iv）将icg和icga与真皮成像方法相结合， （v）更深层成像（光学层析成像）， （vi）光学成像设备开发（腹腔镜检查）和优化，自动化， （vii）为更具体的成像模式开发新的ICG衍生物， （viii）提高ICG的量子效率例如，金属纳米颗粒， （ix）ICG的微纳米封装用于非血管造影应用， （x）提取光谱信息和化学计量学（多光谱成像）[273]，以及 （xi）ICG成像与机器人辅助手术的整合[274]。 在临床环境中，ICG是一种新的独特的淋巴循环系统成像方法，因此提供了全新临床应用的挑战和潜力

缩略语 3D：立体 ALT：股前外侧皮瓣 ASA：美国麻醉学会病人分类状态 AVM：动静脉畸形 BP：血压 BSA：牛血清白蛋白 BSS：平衡盐溶液 CABG：冠状动脉旁路移植术 CCD：电荷耦合器件（相机） CEA：颈动脉末端动脉切除术 DSA：数字减影血管造影 EPR：增强渗透性和保留性 FDA :(美国）食品和药品管理局 FLIM：荧光寿命成像显微镜 FOV：视场FT荧光断层扫描 HDL：高密度脂蛋白 HAS：人血清白蛋白 HUCH：赫尔辛基大学中心医院 ICA：独立成分分析 ICCD：图像增强型CCD ICG：吲哚菁绿 ICG-PDR：ICG血浆消失率 ICG-VA：ICG视频血管造影 ICGA：ICG血管造影术 ICGI：ICG成像 ICG-PDR：ICG血浆消失率 ICU：重症监护病房 IfCG：Infracyanine green IREE：红外线电子内窥镜 ISPI：原位光免疫疗法 LAAA：光活化抗菌剂 LDL：低密度脂蛋白 LDPI：激光多普勒灌注成像 LED：发光二极管 LIFE：腹腔镜胃内全层厚度 切除 MICAD：分子成像和造影剂 数据库 MRI：磁共振成像 NILI：近红外激光照射 NIR：近红外线 NIRF：NIR荧光 NIRS：近红外光谱 NOTES：自然孔口经腔内窥镜手术 OCT：光学相干断层扫描 PAD：外周动脉疾病 PAOD：外周动脉闭塞性疾病 PASP：聚天冬氨酸钠 PBS：磷酸盐缓冲盐水 PDT：光动力疗法 PPG：Photoplethysmography PPT：光热疗法 PV：外周血管系统 PVD：PV疾病 QD：量子点 红细胞：红细胞 RGB：红绿蓝 RP：雷诺现象 RPE：视网膜色素上皮细胞 SLD：超辐射发光二极管 SLN：前哨淋巴结 SLNB：前哨淋巴结活检 SNNS：Sentinel节点导航手术 SNR：信噪比 TTFM：运输时间流量计。