摘要
赛思基因（www.scientsgene.com），注重基因转化技术的应用，致力于打破基因限制，帮助基因编辑育种。
甘薯（Ipomoea batatas）甘薯褪绿矮化病毒是世界上最重要的作物之一（SPCSV）和甘薯红薯病毒（SPCSV）甘薯病毒病毒由共同感染引起（SPVD）而降低。土豆羽状斑驳病毒。然而，改进尚未建立SPVD抗性方法。因此，本研究旨在通过使用 CRISPR-Cas13 其重要的发病机制相关因素之一(即技术靶向) SPCSV-RNase3）来增强 SPVD 抗性。首先，本氏烟草中使用的瞬时表达系统比较了四种 CRISPR-Cas13 变体的 RNA 靶向活性. LwaCas13a 和 RfxCas13d 比 PspCas13b 和 LshCas13a 更有效 RNA 和 RNA 病毒靶向活性。在 pCmYLCV 在启动子的驱动下，RfxCas13d 表现出比 pAtU6 起动子较高 RNA 靶向活性。此外，使用 LwaCas13a 系统靶向 SPCSV -RNase3抑制了其 RNA 沉默抑制活性，恢复本氏烟草叶细胞 RNA 沉默活性。与野生型相比，携带RNase3靶向 LwaCas13a 萝卜花叶病毒转基因基本烟草植物 TuMV-GFP 黄瓜花叶病毒 CMV-RNase3 共感染表现出增强的抗性。此外，携带转基因甘薯植物 RNase3 为目标的 RfxCas13d 系统性能显著提高 SPVD 抗性。这种方法可能有帮助SPVD开发免疫种质SPVD甘薯产量在高发地区增加。
背景
甘薯（Ipomoea batatas）富含维生素、矿物质和膳食纤维，是最重要的粮食作物之一，在全球主食产量中排名第七（Bovell-Benjamin, 2007 , 2010）。甘薯作为一种无性繁殖的块根作物，由于世代相传，甘薯产量大大降低（Loebenstein et al., 2015）。CRISPR-Cas13 可能是比 RNAi 改善红薯的更好策略 SPVD 抗性。在这项研究中，本氏烟草被用作模型植物 Cas13 变体的 RNA 验证靶向活性 CRISPR-Cas13 在工程甘薯 SPVD 抗性应用。LwaCas13a 和 RfxCas13d 被确定为用于 RNA 两种有效的病毒靶向病毒 Cas13 直系同源物。此外，使用 LwaCas13a 靶向 SPCSV - RNase3 宿主细胞可以恢复 RNAi 提高本氏烟草植物对能力的能力 SPCSV-RNase3 病毒协同作用的耐受性。最后，生成RNase3-靶向 RfxCas13d 转基因甘薯植物显著增强 SPVD 抗性。这项研究可能会为红薯抗 SPVD 遗传改进提供了新的策略。
材料与方法
1.本氏烟转基因
携带本氏烟草的叶盘RNase3靶向 LwaCas13a 根癌农杆菌的载体GV3101感染3 天空，然后转移到头孢噻啶 (500 mg/ml) 和卡那霉素 (50 mg/ml) 的 Murashige & Skoog (MS) 转基因本氏烟草植物在培养基中产生。将再生后的2~3 cm剪掉高抗卡那霉素枝，在生根培养基上生根。转基因阳性系通过基因组 DNA PCR 以及从再生植物中收集的叶样的蛋白质痕迹分析。三正线（T 0, RTL1 到 RTL3) 被选中。从三个系中收获的种子含有卡那霉素 MS 筛选培养基。活幼苗用于实验。
2.甘薯转基因
将靶向 RNase3 的 RfxCas13d 或 NT 结构介绍根癌农杆菌 EHA105，在含有 200 μM 乙酰丁香酮和 12.5 mg/L 潮霉素的 YPD 在液体培养基中 200 rpm 在摇床上在 28°C 培养过夜，用于转化甘薯胚性愈伤组织。Xushu 29) 转基因甘薯植物采用农杆菌介导的转化方法 (Kim et al., 2012 ; Yu, Xuan, et al., 2020 ; Zang et al., 2009 )。转基因愈伤组织应在含潮霉素的培养基上筛选。基因组是从再生植物中收集的叶样 DNA PCR 转基因阳性白质印记来确认转基因阳性品系。两个转基因系(一个) NT 一个载体用于选择 RNase3靶向 RfxCas13d 无病毒植物通过芽分生组织培育繁殖。在获得特定数量的无病毒幼苗时，开始嫁接和自然感染试验。
3.甘薯嫁接试验
从田间收集中典型 SPVD 有症状的甘薯植株，并使用 RT-PCR（RNA 病毒）或 PCR（DNA 筛选病毒)。同时选择一株感染 SPFMV 和 SPCSV 然而，显然没有其他植物测试病毒，并在飞网下无性繁殖 2 个月（图 S7）。从这种 SPVD 感染植物繁殖的幼苗被用作嫁接实验中的砧木或自然感染实验中的病毒来源。一个来自 NT 无病毒茎尖和转基因植物的另一个来自RNase3靶向 RfxCas13d 同样的砧木上嫁接了转基因植物的茎尖。记录接穗的生长情况，并在嫁接后14天和21天收集完全展开的接穗幼叶RT-qPCR分析。
4.自然感染实验
将 SPVD 感染的甘薯幼苗和无病毒 WT 甘薯植物、NT 甘薯植物和转基因RNase3靶向 RfxCas13d 转基因甘薯植物含有昆虫载体（SPCSV 的粉虱和 SPFMV 在温室里培养蚜虫。) 6 个月。每两个月剪下幼芽繁殖。六个月后，从三个基因类型中收集的芽的形状被拍照。收集嫩叶 RT-qPCR 蛋白质印记分析。
主要结果
①LwaCas13a 和 RfxCas13d 对 RNA 病毒表现出有效的靶向活性
不同的测试 Cas13 单个系统靶向 RNA 病毒的效率，进行了 TuMV 靶向实验（Aman 等人，2018 年；Mahas 等人，2019 年）。由 AtU6 启动子 (LwaCas13a/PspCas13b) 或 CmYLCV 启动子 (RfxCas13d) 设计和驱动十个和 TuMV-GFP 单个基因组互补 gRNA（图 S4a；NIb或GFP）。然后重组这些靶向载体(图 2a和S1a）。每个靶向载体和 TuMV-GFP 感染性克隆被传递到野生本氏烟草的叶子中，植物通过农杆菌渗透进行测量 Cas13 变体对 RNA 病毒干扰活性。与 TuMV-GFP 基因组不互补的 NT 间隔作为对比。我们的数据显示，PspCas13b 显著抑制农杆菌浸润叶（ILs）和系统叶（SLs）中的 TuMV-GFP 平均干扰效率分别为 50% 和 52%（图 S1 b，c）。LwaCas13a 和 RfxCas13d 几乎完全消除了 IL 和 SL 中的 TuMV 积累（图 2b）。ILs 和 SLs 中病毒积累（ NIb、GFP和CP ）对于平均干扰效率 LwaCas13a 和 RfxCas13d 分别达到 90% 和 89%（图 2c、d)，远高于 PspCas13b。鉴于其较低 RNA 病毒干扰活动(图 S1），PspCas13b 未用于后续实验。
图2. LwaCas13a 和 RfxCas13d 的 RNA 病毒干扰活性。(a) LwaCas13a 和 RfxCas13d 靶向载体示意图。gRNA 表达由 LwaCas13a 的 AtU6 启动子和 RfxCas13d 的 CmYLCV 启动子驱动。DR，LwaCas13a 或 RfxCas13d 的特定 DR。下图代表与 TuMV-GFP 基因组（NIb和GFP）靶序列互补设计间隔。(b) Cas13 介导的对 TuMV-GFP 病毒干扰。本氏烟草单独使用 TuMV-GFP 感染性克隆或和 CRISPR-Cas13 浸润植物的靶向载体组合。在接种后 6 天 (dpi)，荧光激发灯下植物成像检测 GFP 信号。EV，空向量；NT，带有 NT 间隔载体；SL，系统叶；IL，浸润的叶子。（c，d）分别在 IL 和 SL 中对 TuMV- GFP敲低逆转录定量 PCR 分析。对于每个 CRISPR-Cas13 靶向载体(包括) NT），击倒效率显示相对于 EV。值显示为平均值 ± SEM ( n = 6)。目标向量和所有直方图 NT 实现了向量之间的显著差异p < 0.0001 的水平
②通过 RfxCas13d 靶向 SPCSV-RNase3 增强转基因甘薯 SPVD 抗性
为了测试 SPCSV - RNase3靶向 CRISPR-Cas13 甘薯系统能否增强？ SPVD 抗性，我们进一步生成了转基因甘薯植物。设计了一个包含在内的构建体 2 × 35S 表达启动子 RfxCas13d 表达盒、在 AtU6 启动子表达包括三个RNase3靶向间隔子 pre-gRNA 表达盒和增强型 35S 表达启动子潮霉素抗性基因（RfxCas13d-RNase3；图 6a）。没有前 gRNA 表达箱的类似结构作为对照载体（RfxCas13d-NT；图 6a）。还按照与RfxCas13d-RNase构建了3载体相同的原理LwaCas13a-RNase3载体。这些甘薯载体的构建是在本氏烟草植物中的 CmYLCV 启动子实验前。因此，AtU6 甘薯实验采用启动子。
基于胚胎愈伤组织的转化方法（Kim et al., 2012 ; Yu, Xuan, et al., 2020 ）将这些结构转化为栽培甘薯（Xushu 29 ）。分别获得4个和3个用途RfxCas13d-NT载体和RfxCas13d-RNase转基因甘薯系3载体转化。然而，我们没有得到它 LwaCas13a-RNase3 再生甘薯幼苗(数据未显示)的载体转换。两个转基因甘薯品系（RfxCas13d-NT L1 和 RfxCas13d-RNase3 L1)检测稳定性 RfxCas13d 蛋白质表达(抗 FLAG 标签)并选择这些系列进行进一步实验(图 S6）。
图6. 使用 RfxCas13d靶向 SPCSV - RNase3 转基因甘薯植物的改善 SPVD 的抗性。(a) 以 RNase3 为目标的RfxCas13d载体 (RfxCas13d- RNase3 ) 示意图。RfxCas13d 的表达由 35S 启动子驱动，pre-gRNA 的表达由 AtU6 启动子驱动。没有crRNA类似载体用于对照（RfxCas13d-NT）。DR，RfxCas13d 的特定 DR。下图代表与 SPCSV -RNase3.靶序列互补设计间隔。(b) 嫁接实验中尖的生长条件。来自 RfxCas13d-NT 和 RfxCas13d- RNase3的无病毒茎尖将转基因甘薯幼苗嫁接到感染 SPVD 的同一砧木上。(c)嫁接 14 天和 21 天后接穗嫩叶中SPCSV- RNase3和 SPFMV- CP转录物的逆转录定量 PCR (RT-qPCR) 分析。RfxCas13d- RNase3转基因接穗中病毒 RNA 的表达水平相对于 RfxCas13d-NT 转基因接穗显示。列显示为平均值 ± SEM ( n = 6)。(d) 野生型 (WT)、RfxCas13d-NT 和 RfxCas13d- RNase3转基因甘薯植物在自然感染条件下营养繁殖 6 个月后幼叶的 SPVD 症状。(e) SPCSV- RNase3的 RT-qPCR 分析和 SPFMV- CP在三个基因型的幼叶中积累。相对于 WT 植物显示了转基因植物中病毒 RNA 的表达水平。列显示为平均值 ± SEM ( n = 6)。(f) 具有代表性的蛋白质印迹结果显示 RNase3 (anti-RNase3) 和 SPFMV-CP (anti-SPFMV-CP) 在三种基因型的幼叶中积累
在嫁接实验中，将RfxCas13d-NT和RfxCas13d-RNase3转基因甘薯植株的脱毒茎尖嫁接到SPVD感染的砧木上21天（图 6b）。RT-qPCR 数据显示， RfxCas13d-RNase3 转基因接穗中 SPCSV- RNase3和 SPFMV - CP的 RNA 水平显着低于 RfxCas13d-NT 接穗，后者嫁接到相同的砧木上（图 6c）。嫁接后21天，RfxCas13d-RNase3转基因接穗对SPCSV和SPFMV积累的干扰效率分别达到95%和80%（图 6c）。该结果表明 SPCSV -RNase3-RfxCas13d 靶向抑制甘薯植物中 SPCSV 和 SPFMV 的积累。
进行了为期 6 个月的自然感染实验，以测试 RfxCas13d-RNase3 转基因甘薯植物在长期生长条件下是否表现出增强的 SPVD 抗性。将统一的无病毒 WT、RfxCas13d-NT 和 RfxCas13d-RNase3 转基因徐树 29 株植物（图 S8）与 SPVD 感染的甘薯植物一起放置在温室中，粉虱和蚜虫分别是 SPCSV 和 SPFMV 的昆虫载体, 6 个月。WT和RfxCas13d-NT转基因徐树29植株表现出严重的SPVD症状，包括叶片萎黄、畸形和花叶（图 6d）。与其他基因型相比，RfxCas13d-RNase3 转基因徐树 29 植物没有表现出任何 SPVD 症状（图 6d）。RT-qPCR数据显示，与WT和RfxCas13d-NT转基因株系相比，RfxCas13d-RNase3转基因徐树29的幼叶中SPCSV和SPFMV滴度显着降低（图 6e）。与其他两种基因型相比，RfxCas13d-RNase3 转基因徐树 29 的幼叶中病毒蛋白（SPCSV-RNase3 和 SPFMV-CP）的积累在很大程度上受到抑制（图 6f）。这些结果证明，通过 RfxCas13d靶向 SPCSV -RNase3 可增强转基因甘薯植物的 SPVD 抗性。
讨论
RNA 沉默通过产生干扰病毒复制能力的 vsiRNA 作为主要的抗病毒防御机制（Li & Wang，2019）。由 SPCSV 基因组编码的 SPCSV-RNase3 可以通过将 21 到 22-nt vsiRNA 加工成 14-nt vsiRNA 从而破坏宿主 RNA 沉默机制，从而在甘薯植物中激发病毒协同作用（Cuellar 等，2009）。携带 SPFMV 片段的转基因甘薯植物在温室中表现出对 SPFMV 的抗性，而在田间感染 SPCSV 后会失去抗性（Kreuze 等，2008）。此外，携带源自各种病毒的片段的转基因甘薯植物在没有 SPCSV 的情况下表现出对相应病毒的抗性（Sivparsad & Gubba，2014 年）。总之，LwaCas13a 和 RfxCas13d 能够在植物中实现有效的 RNA 病毒干扰，而选择用于 gRNA 表达的启动子对于优化 RfxCas13d 的 RNA 靶向活性很重要。通过 CRISPR-Cas13靶向 SPSCV - RNase3 显着恢复了宿主细胞的 RNA 沉默活性并增强了转基因甘薯的 SPVD 抗性。CRISPR-Cas13在未来创建SPVD免疫甘薯种质的优化和开发方面具有巨大潜力。
赛思基因（www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。