研究介绍： 冷胁迫是世界上重要的经济作物（HtKc，Brassica rapa L.ssp.pekinensis）产量限制的重要因素。然而，HtKc低温胁迫的生化和分子反应尚不清楚。在本研究中，研究者对正常和低温条件下生长的HtKc研究转录组分析HtKc低温胁迫响应的分子机制。共有2131个基因(936个上调，1195个下调)被认定为差异表达基因，并被明显注明为刺激反应类别。此外，低温胁迫通过诱导苯丙素引起HtKc多酚类化合物的积累，包括香豆酸、阿魏酸和芥末酸。化学抗氧化试验结果表明，低温诱导的多酚化合物改善了HtKc清除自由基的活性和抗氧化能力表明，低温胁迫引起的苯丙素有助于HtKc抵抗低温诱导产生的活性氧。综上所述，研究结果将为提高植物耐寒性提供重要基础。 研究目的： 为进一步了解大白菜的冷反应提供了依据；揭示了苯基丙类在冷胁迫下控制细胞氧化还原稳态的作用；总结HtKc通过操纵抗氧化机制，将中冷胁迫引起的分子反应作为未来研究的公共可用资源，提高环境压力的耐受性。 材料及方法： 材料： HtKc（品种Chunkwang）种子在温室发芽(20°C）生长在中间。幼苗均匀生长50 d，然后转移到极端天气生长室（EGC）冷处理。20年一半的植物°C下生长作为对照植物，其余在冷胁迫(10°C）下1天（C1d）或3天（C3d）下生长。五种生物重复。 方法： HtCc冷应激的生理反应 使用便携式LI-COR气体交换系统（LI-COR）分析了冷应力对光合速率和气孔导率的影响。 胸氨酸含量采用比色法定量。胸氨酸含量用各种浓度标准产品制备的校准曲线测量，并用ng /mg鲜重（FW）表示。 抗氧化酶活性分析 为了分析SOD，CAT和POD活性，使用20mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5)根据Bradford方法定量。使用 SOD 检测试剂盒-WST（Sigma-Aldrich）、Amplex Red过氧化氢酶检测试剂盒（Molecular Probes）和Amplex分析SOD、CAT 和 POD 活性?红色过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒（Invitrogen）。 转录组分析： 转录本的水平表示使用HTSeq计数和DESeq每百万次映射reads每千基转录本的片段。DEG以p值为基础.01和|log2（FC）|≥ 1。DEGs表达水平显示为FPKM值的Z-scores。 Blast2GO（https://www.blast2go.com/）用于DEG的GO富集。另外，使用MapMan绘制代谢概述图（http://mapman.gabipd.org/）。 qRT-PCR分析 选择参与光系统，以验证转录组学数据中观察到的表达模式II（PSII）和I（PSI）的基因进行qRT-PCR分析。基因转录水平归一为内部参考基因肌动蛋白。 HtCc非酶抗氧化能力分析 室温下冻干样品MeOH浸泡24小时。过滤后，使用旋转真空蒸发器蒸发MeOH提取物。1-2苯基-2-苦味酰肼（DPPH）确定各提取物的自由基去除活性，并进行氧自由基抗氧化能力（ORAC）两者均由测定Kim等人描述。DPPH值表示减少一半DPPH自由基所需的浓度（IC50），ORAC值表示为Trolox当量（μM TE）的μM。 高效液相色谱分析 使用配备二极管阵列检测器和Poroshell 120 EC-c18色谱柱（4.6 ×150 mm，4μm）测量香豆酸、阿魏酸和芥子酸的含量。在蒸馏水中流动相为0.1%甲酸(流动相)A）和乙腈含0.1%甲酸(流动相)B）组成。香豆酸、阿魏酸和芥子酸的含量是通过比较样品的保留时间、紫外光谱数据和标准产品来确定的。
结果：
图1.大白菜对低温胁迫的生理反应。冷处理后确定脯氨酸（A）、光合速率（B）、气孔导度（C）并选择基因表达量（D）的变化。平均数据±标准差表示。采用Duncan多范围检查，图中不同字母表示组间存在显著差异。C0.植物生长在20岁C(对比植物)；C1d和C3d，植物承受冷应力（10?C）一天三天。
图2、大白菜的低温诱导差异表达基因（DEGs）。DEGs （C1d vs C0，C3d vs C0） 火山图（A）和Venn图（B）分析。基于2131个DEGs的GO富集分析（C）。（D） ICE-CBF-COR级联中各DEGsz分表示热图。C0，植物生长在20?C(对比植物)；C1d和C3d，植物承受冷胁迫(10)C）一天三天。红到绿表示原始z分数。红绿分别表示z分数上升和下降。
图3、冷胁迫对光反应相关基因转录水平的影响。C0.植物生长在20岁C(对比植物)；C1d和C3d，植物承受冷应力(10)C）分别是1天和3天。红色和绿色分别表示上升和下降的下降。
图4.冷胁迫对抗氧化酶活性的影响（A）与冷诱导的编码抗氧化酶的氧化酶的基因（B）。5个独立实验的平均数据±标准差表示。不同的字母表示组间存在显著差异。红色和绿色分别表示上升和下降的z分数。C0.植物生长在20岁C(对比植物)；C1d和C3d，植物承受冷胁迫(10)C）一天三天
图5、低温胁迫对苯丙素途径的影响。（A）冷诱导差异表达基因参与苯丙素途径。（B）香豆酸、阿魏酸和芥子酸的水平采用高效液相色谱法进行评估。平均数据±标准差表示。Duncan多极差测试显示，不同字母表示组间存在显著差异。C0.植物生长在20岁C(对比植物)；C1d和C3d，冷应力植物处理(10)C）一天三天。PAL，代表苯丙氨酸解氨酶；C4H，代表肉桂酸4-羟化酶；4CL，4-香豆素：辅酶A连接酶；CCoAOMT，代表咖啡酰CoA，3-O-甲基转移酶；COMT，咖啡酸/5-羟基阿魏酸3-O-甲基转移酶；CCR，代表肉桂酰辅酶A还原酶；CAD，代表肉桂醇脱氢酶；SCT，芥子酰葡萄糖：胆碱芥子酰转移酶；CHR，代表查尔酮还原酶；CHS，代表查尔酮合成酶；CHI，代表查尔酮异构酶；F3H，代表黄烷酮3-羟化酶；F3′H，代表黄酮类3′-羟化酶；F3′5′H，代表黄酮类3′5′-羟化酶；FLS，代表黄酮醇合成酶；DFR，代表二氢黄酮醇还原酶；LDOX，代表白花青素双加氧酶；UGT，代表UDP-葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶。 插入图片描述
图6、采用DPPH自由基清除（A）和ORAC（B）确定化学基础的抗氧化活性。清除DPPH清除活性和自由基ORAC值分别以IC50和Trolox μM当量表示。平均值±标准差表示（n=5）。Duncan多极差试验表明，不同字母代表组之间存在显著差异。C0.植物生长在20岁C(对比植物)；C1d和C3d，冷应力植物处理(10)C）一天三天。 结论： 了解低温胁迫作物的分子机制是提高植物抗寒性的重要一步。本文总结了低温胁迫下的低温胁迫HtKc分子变化。低温诱导的DEGs表现出不同的抗氧化成分表达模式。此外，化学抗氧化活性分析表明，多酚的积累可能是植物对冷胁迫的主要反应，多酚已被证明可以消除HtKc中低温诱导ROS。因此，为了提高其耐寒性，类化合物的功能应用进行更深入的研究，以提高其耐寒性。研究人员坚信，研究人员的数据是进一步研究的HtKc生化和分子机制对低温胁迫的响应提供了坚实的基础。