Abstract
Denne oppgaven er skrevet som en del av et st?rre forskningsprosjekt der m?let er ? tilegne seg kunnskap om enzymer som katalyserer hydrolyse av den ul?selige polymeren kitin. Kitin best?r av β-(1,4)-bundet N-acetyl-D-glukosaminenheter og er den nest vanligste biopolymeren etter cellulose. Det kitinolytiske maskineriet til den gramnegative jordbakterien Serratia marcescens er et av de mest studerte enzymsystem for nedbrytning av kitin. Enzymsystemet best?r av tre kitinaser; kitinase A (ChiA), kitinase B (ChiB) og kitinase C (ChiC). ChiB er et prosessivt eksoenzym som katalyserer hydrolysen av kitin fra den ikke-reduserende enden. Ved substratbinding dannes det en delvis tunnel som omslutter substratet under hydrolyse, typisk for prosessive glykosyl hydrolaser.
I denne oppgaven har sentrale residuer i denne tunnelen blitt mutert og de termodynamiske signaturene ved binding av (GlcNAc)6 til enzymet har blitt bestemt og sammenlignet mot villtype. Dette er gjort for ? utdype deres rolle ved substratbinding. Det ble valgt ut fem residuer som antatt ? utdype deres rolle ved substratbinding. Det ble valgt ut fem residuer som antatt ? v?re viktige for prosessivitet og dannelse av tunnel ved det aktive setet og to residuer med katalytiske egenskaper. De utvalgte residuene for substratbinding var D316, E221, F190, W97 og W220, mens de katalytiske residuene valgt var R294 og Y145. For ? kunne studere bindingen av (GlcNAc)6 til enzym med ITC, m? kunne studere bindingen av (GlcNAc)6 til enzym med ITC, m? enzymet inaktiveres. Dette gj?res ved ? mutere den katalytiske syren E144 til glutamin (Q).
For de utvalgte residuene for tunneldannelse og binding er det en tydelig trend hvor alle mutantene binder svakere enn villtype. Det var ikke tilstrekkelig reproduserbarhet i dataene for ? kunne regne ut de termodynamiske parameterene til W220A. Av de resterende mutantene hadde alle relativt lik entalpiendring. Mutasjonene E221A, F190A og W97A viser tilsvarende endringer i b?de solvatiseringsentropi og konformasjonsentropi i forhold til villtype. Verdiene for de tre mutantene, E221A, F190A og W97A, tyder p? at residuene er viktig for ? at residuene er viktig for ? tilrettelegge tunnelen og/eller bingingskl?ften f?r binding. Videre tyder mye p? at D316 har stor konformasjonsfrihet f?r residuet l?ses ved binding av substrat. Dette samsvarer godt med ?umbrella sampling?.
N?r det kommer til de katalytiske residuene kan det tyde p? at Y145 ogs? er et viktig residu for ? tilrettelegge bindingskl?ften f?r substratbinding. Mutasjonen R294A viser liten endring sammenliknet med villtype, noe som tyder p? at residuet har liten effekt p? binding. Residuet er vist ? v?re viktig for hydrolyse av substrat.
This thesis is written as part of a larger research project where the main goal is to acquire knowledge of enzymes that catalyse the hydrolysis of the insoluble polymer chitin. Chitin consists of β-1,4-linked N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) units and is the second most abundant biopolymer in nature after cellulose. The chitinolytic machinery of the gram-negative soil bacterium Serratia marcescens is one of the most studied enzyme systems for chitin degradation. The enzyme system consists of three different chitinases; Chitinase A (ChiA), Chitinase B (ChiB) and Chitinase C (ChiC). ChiB is a processive exo-enzyme that catalyses the hydrolysis of chitin from the non-reducing end. Upon substrate binding a partial tunnel is formed by the catalytic site, enclosing the substrate during hydrolysis. This is typical for processive glycoside hydrolases (GHs). In this thesis, key residues in the catalytic domain been mutated and thermodynamic signatures by the binding of (GlcNAc)6 to the enzyme have been determined and compared to wild type. This was done to deepen their role in formation of the deep substrate binding cleft upon substrate binding. Five residues were selected which were thought to be important for processivity and forming tunnel at the active site, and two residues with catalytic properties. The selected residues for substrate binding were D316, E221, F190, W97 and W220, while the catalytic residues selected were R294 and Y145. In order to study the binding of (GlcNAc)6 to enzyme with ITC, the enzyme must be inactivated. This was accomplished by mutating the catalytic acid E144 to glutamine (Q). The selected residues along the cleft showed a clear trend where all mutants showed a weaker binding than wild type. It was not sufficient reproducibility of the sensor data to calculate the thermodynamic parameters of W220A. Of the remaining mutants, all had relatively equal binding enthalpy. The mutations E221, F190A and W97A showed corresponding changes in both solvation entropy and conformational entropy relative to wild type. Values for the three mutants, E221, F190A and W97A, indicate that these residues are important for arranging the catalytic cleft before binding. Moreover, it seems that D316 ha great conformational freedom before the residue is locked upon substrate binding. This corresponds well with the «umbrella sampling». When it comes the catalytic residues, it may indicate that Y145 is also an important residue to arrange the binding cleft before substrate binding. The mutation R294A shows minor change compared to the wild type, suggesting that the residue has little effect on substrate binding. The residue is shown to be important for hydrolysis of substrate.