荧光底物
与色原底相比，荧光底具有较高的检测灵敏度，可同时使用几种不同颜色的荧光材料；但荧光底具有以下缺点：激发和检测荧光需要昂贵的光源、过滤器和扫描仪，检测成本高；荧光在观测或样品存储期间衰减，甚至暴露在室内光下，很难获得恒定值或定量数据；此外，细胞和其他分子产生的自发荧光（一些特定化合物产生的荧光）也会干扰实验结果。
常规荧光材料很难直接用作HRP但它们与酪胺[41(2-氨乙基)–耦合后，苯酚可以HRP沉积发生在作用下。这种基于酪胺的荧光色素沉积技术的正式名称被称为催化报告分子沉积( catalyzed reporter deposition , CARD) ,或者放大酪胺信号( tyramine signal amplification , TSA)。该技术是由Bobrow 等于1989年第一次提出，其应用范围仅限于免疫痕迹和ELISA分析后来延伸到免疫组化、原位杂交等多个领域，广泛应用于基于酶的敏感检测。
与CARD中荧光分子只能与酪胺形成复合物HRP催化沉积不同， Krieg 合成一种2-(2-苯乙烯基)-苯并噻唑衍生物，可直接作为新型荧光底物使用HRP的活性定位,其基本结构式见图1。其中经过优化筛选(E)-乙烯基-3-乙基-1 ,3-苯并噻唑碘化物效果最好，与Alexa与酪胺偶合物相比，这种新型的荧光染色具有很强的特异性和高灵敏度.背景低。总之，通过酶交联苯乙烯基苯并噻唑衍生物 HRP在活性位点附近产生多种荧光色素是替代荧光染料标记酪胺沉积技术的一种很有前途的方法。
图12-(2-苯乙烯基)-苯并噻唑
化学发光底物
化学发光是指化学反应过程中产生的光的发射现象。化学发光和荧光的区别在于形成刺激态分子的刺激能不同。荧光吸收光能刺激分子发射的光，化学发光吸收化学反应过程中产生的化学能刺激分子发射的光。化学发光底物━在酶的作用下，化学键断裂，释放能量形成可见光。图2显示了一种化学发光底物鲁米诺的发光机制。信号采用光电倍增管、雪崩二极管或其它敏感光学检测器进行检测，或照片显影。化学发光检测灵敏度高，背景低，应用广泛。但是这种方法也存在很多缺点;检测仪器价格昂贵,采用胶片显影又不方便;发射光必须随时采集,导致难以得到恒定值数据;要实现高灵敏度检测,需要长达数小时甚至1 d光积分时间等。
图2
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