使用纳米孔测序数据进行16S-DNA条形码研究的计算方法[综述]

通过对16S核糖体RNA（16S rRNA）细菌多样性已广泛应用于环境微生物学中，特别是自高通量测序技术问世以来。这些技术带来的另一项创新是开发新策略来管理和研究大量的测序数据。这种情况刺激了生物信息学领域的快速扩张，并发布了主要用于使用的新工具Illumina下游分析和解释技术生成的测序数据。近年来，第三代测序技术已经开发出来，并与之前的测序策略并行互补应用。特别是牛津纳米孔技术公司（ONT）分子生态学家推出了纳米孔测序技术。纳米孔技术价格低廉，便携性好，测序通量快。这项强大的技术最近通过了16S rRNA分析测试，显示出令人鼓舞的结果。但与以往的技术相比，纳米孔16缺乏分析S生物信息学工具和标准序列。由于其显著的特点，研究人员最近开始在16岁S rRNA测序研究是正确的MinION评估其适用性，并取得了显罗的结果。在这里，我们评估了微生物组应用的研究MinION总结了技术的最新进展。

微生物群落的功能、相互作用和动力学被认为对生态平衡和生命的存在至关重要。在实验室条件下，只能培养不到1%的微生物这一事实[3]对在分类学背景下提供精确的微生物世界规模和研究微生物多样性提出了历史限制。

由于分子系统发育的基础是在1960年代和70年代建立的，所以16S rRNA原核生物分类研究[4]、[5]已广泛应用于基因。16S rRNA亚基是所有原核细胞中的小核糖体（SSU）的一部分，该分子的编码基因具有一些独特的特点，适用于分类分析：1）普遍存在，[6]发现于所有原核生物和古细菌生物中；2)相对较小（?1500 bp）和高度保守的功能[5]，3）16S rRNA基因中可变区的存在是物种间进化速度不同的结果，可用于区分不同的细菌群[7]，[8]，4)物种存在高度保守区。可用于设计基因中识别的不同高变区(共9个，V1-V9)侧翼通用引物[9]。另一方面，使用16S rRNA细菌鉴定存在一些细菌鉴定局限性，包括这些基因在细菌基因组中的复制数是可变的，一些细菌在物种水平上的分类学分辨率低，对生物分类的偏好。为分析选择的可变区[10]取决于序列。

直到1990年代后期，仅在分类学背景下才应用16S rRNA物种[6]、[11]是根据从纯净(多为临床)培养物中获得的单个细菌来定义的。然而，1997年，Pace等人。首次使用[12]Sanger测序采用16S rRNA基因序列首次描述了实验室中不需要培养的微生物群落的组成。这项工作导致了研究微生物群落的通用方法。如今，对16S rRNA进行序列分析仍是研究微生物多样性的金标准，可对临床和环境样品中存在的原核生物进行准确的分类学分析[11]。，[12]。

Sanger微生物群落研究中测序技术的引入标志着微生物生态领域的革命，并彻底改变了评估微生物多样性的方式。然而，这种方法需要分析单个序列，这意味着克隆步骤是研究样品的关键先决条件(图1a）。因此，最多可生成约1000个碱基序列。由于Sanger平台的通量（表1），限制可分析序列数。因此，就时间和成本而言，使用Sanger对细菌多样性的综合评价已成为一个严峻的挑战。

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图1。最常用的各代测序技术DNA条形码测序策略。（a）第一代测序（Sanger）。在这种方法下，经典的条形码是通过环境编码的DNA样品中全长16S rRNA基因来完成。一旦获得扩增子，将进行16S扩增子克隆，将序列添加到载体中，然后转化为宿主。最后，通过Sanger该方法提取和纯化质粒，并提取和纯化16S rRNA插入片段进行测序。（b）第二代测序（Illumina）。从环境DNA样品中，进行de 16S rRNA基因特定区域PCR扩展；根据研究范围，可扩展16S一两个基因区域，其中最常用的区域是V1-V2和V3-V4.配对的终端文库通常用于使用这些区域（DNA与末端连接有接头的片段和末端DNA制备片段混合物，并准备测序)，测序接头(连接核酸分子的外源核酸)和索引(唯一DNA序列连接到测序库中的片段，允许在同一测序操作中对不同样品进行后验分选和鉴定)添加到16S扩增子极端，最终测序出长度约300 bp的文库在Illumina MiSeq平台上。（c）第三代测序(纳米孔)。（c）第三代测序(纳米孔)。这种最近开发的方法从环境中使用通用引物开始DNA扩增全长16S rRNA基因。同时，在同一时间PCR在反应中，在扩增子中化的指标添加到扩增子中；一旦扩增子被纯化，文库的制备过程包括16S蛋白质(文库制备10分钟)添加到扩增子的特定标记区域；最后，样品的直接测序是MinION在测序仪上进行。

表1。使用DNA16条形码法S可用测序平台对宏基因组分析的比较。

高通量测序或第二代测序在全球范围内（SGS）技术的出现及其在实验室的快速广泛应用代表了微生物生态学的范式转变。这些新技术提供的特点是高输出和数据准确性，以及消除繁琐和耗时的步骤，如Sanger克隆需要测序DNA片段与测序产品的电泳分离，使得在短时间内产生大量的测序数据成为可能。不同创高通量测序的不同公司中，Illumina在市场上处于领先地位，已成为微生物生态学研究中最常用的标准测序技术[13]和[14]。该技术生成的序列中的常见元素是长度缩短（从50 bp到300 bp），高通量（从2 Gb到750 Gb），高精度和降低的成本（大约从每Gb 从40美元开始，译者注应该是Miseq价格)[15](表1)。

但是，由于Illumina和Sanger序列长度的技术差异，单独使用Illumina无法获得16个测序S rNA基因的全长序列。为了克服这一限制，通常使用Illumina进行16S基因分析仅限于16S rRNA的特定可变区，而不是完整的基因（图 1b）。但是，就输出，准确性和速度而言，Illumina测序的显蓍特征使这项技术成为了迄今为止基于16S分析的几乎所有最重要研究的技术，包括人类微生物组计划[16]，地球微生物组计划[17]和极端微生物组计划[18]。

高通量测序技术带来的另一项创新是需要新的策略来管理和研究生成的大量测序数据。从用户的角度来看，这种变化涉及从标准计算机中普通用户可访问的基本计算机程序的应用到对需要高级生物信息学技能的复杂计算分析的需求。这种情况刺激了应用于微生物生态学研究的生物信息学领域的迅速扩展，主要是因为发布了用于下游分析和测序数据解释的新工具。如今，有大量强大的工具可用于有效集成不同类型的数据[15]，[16]，[17]。

在这种情况下，目前有几种用于处理扩增子测序数据的生物信息学程序和工具，其中大多数设计用于16S rRNA基因的V3和V4可变区。进行16S扩增子分析的最受欢迎的软件包是QIIME [20]，MOTHUR [21]和Phyloseq [22]。特别是对于16S宏基因组学研究，标准分析软件包和流程通常包括一个工作流程，该流程包括多路分解和质量控制步骤，然后生成操作分类单元（OTU挑选）和/或“扩增子序列变异分析”（ASV）分析，允许对代表性序列进行分类分配和样品的多样性分析（图2）。因此，序列的生物分类分配是关键步骤，也是微生物多样性分析中最有用的元素。

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图2 经典流程MOTHUR [21]和QIIME2 [20]及其用于16S rRNA扩增子分析的完整工作流程，“通用过程”流程包含两个流程中的所有通用步骤。

图2显示了16S rRNA Illumina序列最常规工作流程的详细流程。尽管不同程序包之间存在差异，但是工作流中的主要组成部分是模拟的，并且共享一个通用过程，包括：序列的质量控制，聚类或ASV分析，分类分配和多样性分析（图3）。

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图3。推荐的MinION 16S rRNA扩增子管线用于细菌多样性分析。[90]，[91]，[92]

近年来，已经开发了第三代测序（TSG）技术，并已与前一种测序策略并行和互补地使用。这些新技术可以实时检测单个DNA分子，并产生非常长的读取（从1到100 kb）。2011年，太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences）引入了首个TSG技术，称为单分子实时测序[19]，[ 20]。新测序仪，特别是Sequel的最新版本，通过将读取长度和每次运行的吞吐量分别增加10倍和100倍，提高了输出。但是，尽管该新平台比以前的版本便宜两倍，但其成本效益仍低于Illumina，因此该平台在16S宏基因组学研究中的应用仍然很少。此外，错误率与第一个PacBio版本相同（〜13％）[25]，并且输出仍然低于Illumina。因此，价格和有限的产量限制了PacBio系统在微生物群落研究中的应用[22]，[23]，[24]（表1）。

纳米孔测序为16S rRNADNA条形码研究带来了第一代和第二代测序的好处。ONT平台会产生长读，从而可以通过快速，廉价和高通量的过程覆盖16S rRNA基因的全长序列（V1-V9区）。全长16S rRNA序列最相关的优势之一是，由于在分析中考虑了16S rRNA基因的所有信息位点，因此它们为细菌鉴定提供了更高的分类学和系统发育分辨率[36]。通过Illumina测序，对16S rRNA进行测序的常规策略使用高变区V1-V2和/或V3-V4[ 37]，并且仅基于大约〜300 bp的16S rRNA基因的这些短可变区来分配分类法。在大多数情况下，对这些短区域的分析提供了有限的分类学分辨率，无法可靠地区分超过属水平的序列[31]，[32]。此外，这些区域的选择将直接影响分类学分配的特异性。例如，在宿主相关研究中，V4区域更好地代表了整个细菌的多样性，而V1-V2对皮肤微生物群的研究更具特异性。此外，当使用16S rRNA基因的不同部分时，不同细菌类别的生物分类学分辨率也不同[40]。相比之下，通过纳米孔测序获得的分辨率仅可与Sanger 16S rRNA测序所提供的水平相提并论，具有在分类群之间更好地区分，更深的系统发生信号以及更准确的16S rRNA纳米孔序列分类学定位的潜力[34]。，[31]，[30]。ONT的另一个优点是，可以在较短的运行时间（1-48小时）内以可承受的价格（每个样本约50美元）生成数据。表1。

如前所述，MinION是当今最受欢迎的ONT平台之一，已被广泛用于基因组学和转录组学研究[35]，[36]，[37]，[38]，[39]，[40]，并且在过去两年中，有关微生物多样性的研究正在迅速发展。但是，尽管在微生物生态学研究中使用ONT技术具有明显的好处，但是仍然有一些因素限制了在微生物多样性的常规分析中采用这些新方法。专门设计用于16S基因全序列的工具的稀缺性使得对纳米孔序列进行专门的分类学分析极为困难。此外，纳米孔16S序列质量有限表示使用其他技术（主要是Illumina）设计的现有工具来分析这些序列的严重限制。

使用纳米孔测序来描述微生物多样性的研究通常采用与以前的研究类似的方法，这些研究大多基于Illumina，无论纳米孔产生全长16S序列的事实如何。使用Nanopore，可以使用通用引物（27F和1493R）通过PCR扩增全长16S rRNA基因。通过在扩增子序列中添加接头来制备文库，并使用握在MinION设备上的Flowcell直接对样品进行测序（图 1c）。

作者试图通过使用两个基于PCR步骤的协议来标准化不同的基于16S的扩增子条形码协议，第一个过程是扩增16S rRNA基因，第二个过程是添加用于16S扩增子测序的接头[48]，[49]。另一种策略是基于使用ONT 1D2化学文库制备方法，其中两条DNA链都已测序（类似于Illumina的配对末端测序），通过对目标DNA的两条链进行测序来提高读取质量[50]。尽管在已发表的研究中使用纳米孔测序对16S rRNA-DNA条形码进行了不同的研究，但牛津纳米孔技术公司的16S条形码试剂盒已被广泛使用，并获得了令人满意的结果[41]，[42]，[43]，[44]。

与样品制备相似，引入的用于分析纳米孔16S扩增子的方法学包括多种生物信息学工具。尽管如此，尽管使用了不同的工具，但所有已发表研究的中心过程都是基于分类分配的策略的应用[44]，[43]，[45]，[47]。

由于大多数已经开发出来分类分配的分析工具只可用于Illumina数据，不能用于纳米孔序列，因此尚未系统地探索使用全长16S rRNA序列的潜在好处。完整的16S基因序列提供的更深的分类学分辨率可以比其他方法[68]，[69]和[70]达到更高的特异性，达到属和种的水平。这种方法已成功应用于工业过程的临床，法医和质量控制中，由于其与医学/人类的相关性，许多待鉴定的微生物在数据库中得到了很好的表示[29]，[61]。

但是，在以前没有研究过微生物群落的其他生态环境中，分类学分配并不总是最好的方法。在这种情况下，生活在这些生境中的最具代表性的微生物可能仍未开发，因此它们的基因组数据不在数据库中，这使得无法对许多 reads进行分类学鉴定。由于数据库主要由16S rRNA基因的片段组成，并且全长序列的存在通常是一个例外，而不是常规，这种情况可能对纳米孔数据更为严峻，这限制了基于完整序列的可靠分类学鉴定基因。另一方面，没有分类分配的大量reads的存在直接影响了对样品中生物多样性的现实测量，从而导致对物种真实数量的低估。在这种情况下，如第2节所述，为克服这些局限性以及由直接分类法读取的 reads引起的偏差，通常将诸如操作分类学单元（OTU）拾取和/或去噪管线之类的方法用于16S Illumina数据分析[71]，[72]，[73] OTU拣选和ASV分析均减少了代表性序列的重复和错误，并允许在无数据库限制的情况下分析细菌群，从而实现了更可靠的分类分配，从而实现了更强大的功能微生物群落的定义（表3）。

表3 用于16S rRNADNA条形码纳米孔数据的生物信息学工具。

为了执行分类分配和多样性分析，需要执行这些分析（图3）。如前所述，在Illumina测序管线中最常使用DADA2和Deblur之类的工具。但是，由于Nanopore 16S读取的特殊特性（长度和质量），DADA2和Deblur或基于ASV检测的任何其他算法的使用，至今尚无法用于Nanopore数据。通常通过纳米孔测序引入的错误数量（主要是插入/缺失）代表了在reads之间发现相似性的相当大的限制。此外，由于reads质量差而导致的人为序列差异，即使它们来自单一生物体，也可能产生以下效果：将每个 reads识别为单个序列变异体，从而高估了细菌多样性[71]。因此，使用不适当的OTU聚类工具或使用ASV方法对Nanopore reads进行分析可能会提供样品微生物多样性的完全不正确的图片，显示出具有非常不同序列的数据集。

因此，尽管ASV方法是评估细菌多样性的最完整方法，但是它对于纳米孔数据分析是不可行的，唯一可用的选择是基于OTU的聚类方法的应用。然而，当应用最流行的聚类算法[74]，例如UCLUST [75]，VSEARCH [55]或CDHIT [76]时，可以发现与使用ASV识别的局限相似的局限性。在最近的研究中评估了使用流行的流程QIIME分析纳米孔16S序列的情况[50]，表明该工具在OTU选择步骤中失败，这证实了上述将Illumina设计的工具应用于纳米孔数据的问题。通过执行封闭或开放参考OTU聚类，将仅对一小部分数据进行聚类，并且数据集的主要部分将由单例组成，这会导致对样本中细菌多样性的错误高估。

如前所述，读取质量是纳米孔数据分析的最重要限制之一。碱基检出是提高序列质量的最决定性的过程。纳米孔测序基于检测DNA链穿过纳米孔而产生的电流变化。理想情况下，每个基极都应具有特定的电流变化，称为事件。每个事件都通过当前的均值和方差以及事件持续时间进行总结[77]，[51]。将该事件翻译成DNA序列称为碱基检出过程。ONT的原始basecallers使用隐马尔可夫模型（HMM）的基础上，使用机器学习然而当今新的策略在所有的现代纳米孔序列basecallers，如Guppy，DeepNano，和Chiron[77] ，[78] 。这种基于机器学习的碱基识别程序使用可以使用实际测序数据进行训练的神经网络。已经证明，使用机器学习方法可以有效提高纳米孔测序数据的质量，并限制原始数据中常见的碱基修饰，插入和缺失的影响[79]。因此，在纳米孔数据上使用这些新的机器学习方法对于改善序列质量至关重要，并且短期内可能会允许对纳米孔序列进行必要的改进，使其超出16S序列的分类分配范围。

最后要考虑的重要一点是Illumina和Nanopore测序技术产生的读取方向的差异。使用Illumina，从测序开始就定义了读取方向，因此序列都处于相同方向，这极大地促进了生物信息数据分析。测序数据的这种同质性对于比对和聚类至关重要，因为可以更轻松地比较 reads。另一方面，利用纳米孔的一维测序化学，可以将接头连接至DNA模板的一端或两端[71]DNA链以随机方向测序。因此，在碱基检出过程之后，数据集由彼此不互补的正向和反向序列组成。因此，为达到一致的结果，在分析纳米孔数据之前，必须结合一个额外的步骤来评估读取的方向，这一点至关重要。

根据前面各节中讨论的有关使用工具及其在纳米孔序列上的应用的要点，在图3中提出了16S rRNA数据分析的工作流程。

随着现代测序技术的出现，基于微生物16S rRNA基因分析的微生物生态学研究已成为DNA条形码研究中最流行的技术之一。迄今为止，大多数使用纳米孔序列进行的研究均报告了适用范围狭窄的流程，通常使用特定的生物信息学方案来检测特定病原体或目标细菌群或分类群，而无需考虑对样品中存在的整个微生物群落进行分析。但是，当前大多数比对器，聚类算法和工具都无法处理Nanopore数据[74]，这对于进行更全面的Nanopore 16S rRNA数据分析仍然是一个挑战。

由于分类分配带来的潜在偏差，OTU聚类可能代表了更方便的选择。在这方面，为转录组创新簇开发的新工具可能代表了未来的探索选择[66]，[67]。正如一些转录为基础的研究已经与纳米孔进行的，一个可能的替代方法是应用这些品种为工具 de-novo 对源自单个基因的所有转录本进行聚类，并应用相同的策略将样品中16S基因的所有变异聚类。此外，已经开发了其中一些工具来处理纳米孔序列的特定特征，因此，可以用作对来自纳米孔的16S序列实施特定聚类工具的第一种方法。

最后，自从新测序技术的发展以来，数据分析的许多挑战浮出水面。正确使用可用工具有助于扩大对纳米孔的16S数据的使用，以进行微生物成分的首次评估。对于Nanopore，根据该技术的消费者和最终用户的需求，工作主要集中在设计用于碱基识别，样本数据分离和物种分类分配的工具。当然，我们仍处于基因组革命的第一步，未来将为扩展这些技术和开发新一代强大的生物信息学工具带来新的可能性。有关身份，对齐方式，并且还必须评估每个数据集的数据库选择，特别是如果需要在物种级别进行识别的情况下。ONT于2019年发布的Flowcell新版本（R10）采用了一种新的化学方法，将显蓍改善数据的质量和数量，共识精度达到99％，输出50 Gb。纳米孔输出的所有这些发展将为生物信息学分析带来新的挑战，但也将带来革新微生物生态学研究的新机会。