数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可以让你直接数出来DNA分子的数量是对起始样品的绝对定量。
数字PCR是近年来发展迅速的定量分析技术。该技术的结果不依赖于扩展曲线的循环阈值（Ct），不受扩展效率的影响，具有良好的准确性和再现性，可实现绝对定量分析。数字PCR在核酸检测、鉴定等研究领域具有巨大的技术优势和应用前景。本推送主要介绍dPCR历史与发展，dPCR基本原理和商业化dPCR平台及其特点。
在定量PCR当我们经常纠结一个问题，是相对定量还是绝对定量？现在，你不用担心，因为数字PCR（digital PCR）来了。虽然这两种技术有些相似，但都估计了起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR核酸量由标准曲线或参考基因测量，而数字PCR可以直接数出来DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。所以特别适合依赖Ct复制数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能直接读出DNA分子的数量是核酸分子的绝对定量。dPCR起源于Cetus Corporation研究人员证明，1988年首次发表的方法可以通过PCR单个检测和扩展β-珠蛋白分子。这是通过将样品分开来完成的，所以有些反应包含分子，而另一些则不包含。1990年，Peter Simmonds和AJ Brown第一次用这个概念量化分子。Alex Morley和Pamela Sykes该方法作为核酸定量技术于1992年正式建立。
1999年，Bert Vogelstein创建了数字PCR这篇文章正式在美国科学院杂志上报道PNAS，并表明该技术可用于发现罕见的癌症突变。作者是美国癌症研究者霍华德·贝尔特·福格尔斯泰因（Bert Vogelstein）。
将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至少包含一个复制目标分子( DNA 模板) ，目标分子分别在每个反应单元中进行PCR 扩展后，对各反应单元的荧光信号进行统计分析。
文章通过在结肠癌患者粪便中检测KRAS基因突变，重点突出dPCR由于定量检测的能力和潜力(PCR是指数过程，所以qPCR文章只能观察两倍的扩展差异，但重点是dPCR区分这种微小差异的能力)。但本文仅将样本分配到384孔板中，用不同的荧光检测突变基因和正常基因，并计算突变基因和正常基因的比例。虽然样本需要分配到更多的微孔或液滴，以提高检测性能，但基本思想是不可分割的Bert Vogelstein所建立的dPCR理念。
2003年，Kinzler和Vogelstein继续完善dPCR，并创造了一种改进的方法，他们称之为BEAMing技术，即珠子、乳液、扩增和磁性的首字母缩写。BEAMing乳技术利用乳液在单个试管中分离扩展反应。这种变化可以在一次运行中进行PCR扩展到成千上万的反应。
自此，关于dPCR建立了两种形式(芯片和液滴)的基本方法，dPCR商业化方面，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等厂家相继推出技术成熟的数字PCR产品。
QuantaLife公司开发的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年Frost & Sullivan北美新产品创新奖。Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术相继推出QX100、QX200微滴式数字PCR系统。
目前dPCR芯片型和液滴型主要有两种形式，但基本原理是将大量稀释的核酸溶液分散到芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板少于或等于1个。这样经过PCR循环后，有核酸分子模板的反应器会给出荧光信号，没有模板的反应器会给出荧光信号。原溶液的核酸浓度可根据相对比例和反应器体积计算。
样品可以用几种不同的方法分配，包括微孔板、毛细管、油乳剂和带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品的分布使人们能够通过假设分子种群遵循泊松分布来估计不同分子的数量。根据泊松分布的原理，反应系统中目标分子的复制数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算解决了单个液滴中存在多个目标分子的可能性。
同时，从公式中也可以看出，反应阳性系数（X）随着X的不断增加，系统中目标分子的拷贝数与X之间会有很大的差距。PCR结果的不确定性也随之提高。一般来说，数字PCR阳性系统的数量不得超过总体系数量的80%。另一方面，N增加会使整个数字PCR系统具有较大的线性范围，可以提高反应的灵敏度、稳定性和可重复性。因此，目前dPCR在成本可控的情况下，需要增加分配的腔室数和液滴数。
到目前为止，市场上很常见dPCR主要有两种:微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技术。芯片型dPCR制造芯片的成本很高。目前，微滴式dPCR企业越来越认可。
cdPCR(芯片式)主要是Fluidigm公司的BioMark HD系统以及Life Technology公司的QuantStudio 3D以系统为代表。Bio Mark该系统采用微泵阀芯片，以聚二甲基硅氧烷为芯片材料，主要依靠微流量控制通道和阀门的原始系统分割，在芯片反应仓库PCR反应，然后通过类似基因芯片的方法扫描每个通孔的荧光信号，计算目的序列含量。QuantStudio 3D系统采用阵列微池芯片，反应液从进样孔直接进入各微反应池。芯片式dPCR微滴体积均匀，稳定性高，系统间影响小，但技术操作复杂，通量有限，实验成本高。
ddPCR(微滴式)主要有Bio-rad公司开发的QX200系统和Rain Drop系统，QX200可将系统分成2万个微滴，Rain Drop可分为100万-100万 000万个微滴。ddPCR原则是通过分析一个待分析的原则PCR微滴处理采用微滴发生器制成反应系统近20 000个油包水小微滴将原有系统分割，样品中的核酸分子随机分配到大量独立的微滴中，每个微滴中含有一个或不含待检查的酸分子。在对微滴系统进行扩展反应后，分析每个微滴的荧光信号，判断是否存在。根据泊松分布原理，通过和内参核酸的阳性微滴数量和比例，获得靶分子的复制数和浓度。与芯片式dPCR相比，操作简单，可以实现高通量的检测，也保证一定程度上的微滴检测稳定性。
Bio-Rad基因表达部的销售经理Richard Kurtz说，公司ddPCR独特的优点是产生非常均匀和重复的1纳升液滴。优点是每个样品形成2万个液滴，其他系统只能分为760-3万个部分。分数越多，分析就越准确。
数字PCR是核酸分子绝对定量技术。目前，核酸分子的定量方法有三种：（1）光度法基于核酸分子的吸光度；（2）实时荧光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值是指能检测到荧光值对应的循环数；(3)数字PCR基于单分子的最新定量技术PCR核酸定量是一种绝对定量的计数方法。主要采用微流控学热点研究领域的微流控制或微滴法，将大量稀释的核酸溶液分散到芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板少于或等于1个。这样经过PCR循环后，有核酸分子模板的反应器会给出荧光信号，没有模板的反应器会给出荧光信号。原溶液的核酸浓度可根据相对比例和反应器体积计算。
与常规的PCR与方法相比，dPCR优势很好。
常规PCR和实时荧光PCR已知拷贝数的标准需要定量检测DNA制定标准曲线，因为样品测量在各种条件下不完全一致，会造成PCR扩大效率的差异会影响定量结果的准确性。ddPCR绝对定量可以进行，不受标准曲线和扩力学影响的情况下进行。
在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。
ddPCR本质上是传统的PCR反应分为数万个独立的反应PCR在这些反应中，可以准确检测到目的片段的小差异、单副本甚至低浓度混合样品，避免形成非同源异质双链。
由于目的序列分布在多个微滴中，显著减少了系统之间的影响，以及背景序列和抑制物对反应的干扰，扩展基质效应大大降低。
具体每种PCR如下表所示：
于此同时，dPCR数字也有一些缺点PCR系统成本高，通量有限，操作繁琐。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系统复杂性高，商业化优势不是特别明显，特别是目前大多数分子诊断qPCR也能很好地满足需求，dPCR增加的收益成本比不高。与芯片式相比，液滴式的成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR扩展和检测分别在不同的仪器中完成，增加了大量的操作和系统的复杂性。从这个角度来看，自动荧光定量PCR做得更好。
尽管dPCR被称为第三代PCR技术，但dPCR技术的广泛应用逐渐显示出一些不足。通量低，操作复杂，成本大幅增加，dPCR似乎还没有找到相对的qPCR足够不可替代的优势。另一方面，dPCR它增加了许多技术困难，如何制造低成本的芯片，如何集成液滴生成和PCR扩展，如何进行敏感的信号检测和分析，如何提高自动化程度，实现Sample-In Resul-Out。相较于Digital ELISA能够提高免疫检测的灵敏度到fg/mL级别，实现了高敏蛋白的检测，dPCR尽管发展更早，却难以取得Killer Application，或许这也导致了所谓的第三代PCR在很多人看来却没那么“下一代”。