文章目录
- 1. siRNA/shRNA 的 RNAi 操作流程
- 2. siRNA 设计
-
- 2.1 设计途径
- 2.2 预设计的 siRNA 库
- 2.3 使用在线软件设计 siRNA
- 3. 构建 shRNA 重组载体
- ： 干货 | 寻找基因启动子，UCSC&Ensembl来助威！
1. siRNA/shRNA 的 RNAi 操作流程
- ：约 的双链 RNA。 ① ：组装在细胞内 RNA 沉默复合物的诱导 RISC，切割 mRNA，促使 。是两端结合。 ② ，与目的 DNA 结合，产生大量 siRNA，放大 RNA 干扰的作用。
- 具体的
siRNA用导入细胞，但 siRNA 只能，只能工作两三天，然后降解， siRNA 的不一定能很显着； - 也可以把 siRNA 的前体 （短发夹 RNA）导入细胞，shRNA 切成细胞 siRNA，从而发挥基因沉默的作用。shRNA 除了表达载体除了发挥短期作用外，还可以与病毒包装质粒一起使用，(慢性病毒、腺病毒等。)，感染细胞后可以通过抗性基因筛选获得稳定的表达 shRNA 细胞系，即能够细胞系的目的基因。
- 现在国内公司可以快速廉价定制 siRNA我们可以完全合成化学片段在使用，在需要，将相应的 实现这一目标。
- RNAi 技术的重点是 。
- ： 1、siRNA 设计 2、shRNA 退火 3.酶切并回收载体片段 连接载体和 shRNA 片段 5、转化 6.挑克隆鉴定 7.扩大阳性克隆的培养，提取质粒
2. siRNA 设计
2.1 设计途径
- ：寻找已经（首选）
- ：包含已经 siRNA 片段
- ：、siRNA at WHITEHEAD（blast 库长期未更新，备选) 一般设计：AA（N19）TT
2.2 预设计的 siRNA 库
- https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/sirna
- ：在搜索框中输入基因名搜索( 为例）→点击左侧的 快速查找→点击 ，列表出现，设置筛选条件，查看详细信息→ 标记已验证的干扰靶点，以消除干扰靶点(只有靶向目的序列的概率很低，可能与其他未知序列相结合 mRNA 上导致目的 mRNA 无变化，或结合未知 mRNA 上导致目的 mRNA 沉默）。
- (目前只显示靶序列) ◆ ：酶在转录时遇到 polyT 停下，；读第二个 T 后被, siRNA 带 TT 有助于组装 RISC 复合物。 ◆ 可以利用 。例如：CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTTG，序列保存成 .seq 文件，导入 DNAMAN → Sequence → Sequence Structure → Current Sequence → OK。
2.3 使用在线软件设计 siRNA
-
选择 siRNA 选项（现在没有了，可以选Stealth RNAi? siRNA、shRNA等等，使用方法相同)
-
输入靶基因 Accession number（如：，现在无效） 或。
-
如果输入是 Accession number，默认选择靶序列区域 ORF（CDs 序列）。
-
3.选择种属。
-
4.其他默认点 RNAi Design。
-
在生成的引物中选择星号较多的，。
-
： ◆ 订购化学，直接导入细胞 RNA 干扰。即软件筛选出的序列，并在反向互补序列中 。 ◆ 。
3. 构建 shRNA 重组载体
-
Sigma 直接提供的 shRNA 产品用的是
pLKO.1-puro载体。 ◆ 使用的启动子是 。U6或H1是，例如，启动短序列 shRNA。 ◆ 构建建议用，如CMV、EF1起动子，起动效率更高，可以有组织特异性，可以选择组织特异性的二型起动子。 -
： ◆ 前酶切位点为
AgeⅠ的插入片段粘性末端。 ◆ 后面的酶切位点是EcoRⅠ插入片段粘性末端。 -
：
-
3、退火： ◆ ： ◆ ： ，自然冷却至室温。 -
4、。