PI 染色检测细胞凋亡的原理

• PI (propidium iodide)，碘化丙啶，是一种核酸染料，既能染 DNA，也能染 RNA，能发出红色荧光。

• PI 不能通过细胞膜完整的细胞 （如活细胞和早期凋亡细胞） 。

• 需要先将 RNA 去除以排除 RNA 的干扰。

• 正常细胞的 DNA 是完整的，PI 能将这些细胞深染，而凋亡细胞中 DNA 是断裂成一段一段的，PI 也能结合上去，但是染色没那么深。

• 参考：PI 染色法检测细胞周期

PI 染色检测细胞增殖的操作流程

• 适用于检测培养的细胞，不适用于检测组织样本。

1. 消化收集细胞：收集 细胞培养上清（可能是凋亡的细胞）和贴壁细胞，用含 EDTA 的 0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS 终止消化后，将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中，1500rpm 离心 5min 沉淀细胞，弃上清。
2. PBS 洗：加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀， 1500rpm 离心 5min，弃上清，以充分去除残留的 FBS 和胰酶。
3. 固定：加入 2ml -20℃预冷的 70%乙醇重悬细胞沉淀（加乙醇时应注意边加入边轻柔吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测），4℃固定 30min 或 -20 ℃固定过夜后， 1500rpm 离心 5min，弃上清，去除残留的乙醇。
4. PBS 洗：加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞沉淀， 1500rpm 离心 5min，弃上清后， 500ul PBS 重悬细胞。
5. RNA 去除：加入 RNase A（工作浓度 20μg/ml），37 ℃孵育 30min，充分降解细胞内 RNA，后 1500rpm 离心 5min，弃上清。
6. PI 染色：500μl PBS 重悬细胞沉淀，加入 25ul PI 染液（工作浓度 50μg/ml），冰上放置避光孵育染色 30min。 PI 推荐： eBioscience 00-6990 （按说明书 5μl PI 加入 100μl 细胞）
7. 流式细胞仪检测：染色后的细胞过 300 目筛，置流式管中上流式细胞仪检测，如果暂时不能检测 4 ℃ 冰箱保存待测。

PI 染色检测细胞周期实验分组设计

• 除了空白对照、阴性对照、实验组，还需要准备未染色的空白细胞，用于流式细胞仪检测时调背景参数等。
• 独立重复做 3 次。

数据处理与绘图

• 使用专用软件分析流式数据（可以使用 FlowJo），得到得到 Sub G₀ 比例。

• 将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。

• A：正常细胞，无 Sub G₀ 峰。 B：凋亡细胞，因 DNA 片段化，有明显的 Sub G₀ 峰。

• 参考： FlowJo 流式数据分析基础——常见术语 Flowjo 分析细胞功能实验数据

TUNEL 染色检测细胞凋亡的原理

• TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling，脱氧核苷酸末端转移酶 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记）
• TUNEL 法要素：TdT 酶、dUTP、DNA 缺口标记。 ◆ TdT 酶：末端脱氧核苷酸转移酶，是一种不需要模板的 DNA 聚合酶，可以往 DNA 上加碱基，可以催化脱氧核苷酸结合到分子的 3’-OH 端，带有凸出、凹陷、或平滑末端的单双链 DNA 分子都可以作为 TdT 的底物。 ◆ dUTP：2’-脱氧-5’-三磷酸尿苷，在 PCR 和 rtPCR 反应中可以替代 dTTP，从而防止扩增的干扰，导致产物中含有尿嘧啶。 △ 使用 dUTP 的 TUNEL 法是基础版，plus 版用 BrdU、EdU 替代 dUTP，因为 BrdU、EdU 插入 DNA 的效率比 dUTP 高，且 BrdU、EdU 有抗体，可以再用抗体检测 BrdU、EdU。 ◆ DNA 缺口标记：即检测到的阳性信号应该是位于 DNA 缺口处的。
• 正常细胞基因组断裂很少，细胞凋亡时，DNA 内切酶激活，切断核小体间的基因组 DNA，断裂造成的缺口处会出现很多暴露的 3’-OH。
• TdT 酶可将标记的 dUTP 加到暴露的 3’-OH，根据标记可以进行后续观察。FITC 绿色荧光标记的 dUTP 通过荧光显微镜或流式细胞仪检测，生物素标记的 dUTP 用 DAB 显色后通过显微镜检测。
• TUNEL 法一旦检测到细胞凋亡，就说明细胞已经到凋亡晚期了，因为细胞凋亡晚期时 DNA 才被切成一段一段的，早期不容易检测到。

TUNEL 染色检测细胞凋亡的操作流程

• 适用于检测培养的细胞爬片、悬浮细胞的甩片或涂片、石蜡组织切片或冰冻切片样本。
• 样本不同，处理方式有所不同：

1. 样品准备： 细胞爬片：将灭菌玻片放入 24 孔板，单细胞悬液加入孔中培养过夜。 石蜡/冰冻切片：脱蜡水化。
2. PBS 洗： 细胞爬片准备好后 PBS 洗 1 次， 5min。 （如果细胞贴得不牢，可以干燥样品，使细胞贴得更牢，或省略此步直接固定）
3. 固定：贴壁细胞或细胞涂片用 4%PFA 室温固定 30min；冰冻切片用 4%PFA 室温固定 30-60min（不要使用酸性固定液，容易导致出现假阳性；不要使用乙醇或甲醇固定，会导致后面 TUNEL 标记效率降低） ；石蜡切片可短暂固定 5min（脱蜡水化后如果怕片子掉，或后续操作步骤多，片子变得乱糟糟不好看，可以再用 4%PFA 做后固定 5min） 。 ◆ 无论是什么样品，固定一定要迅速且充分，因为有的组织核酸酶活性比较高，容易出现假阳性。 固定时间不宜过长，会导致蛋白和 DNA 交联在一起，降低 TUNEL 标记效率。
4. PBS 洗：弃固定液， PBS 洗 3 次，每次 5min。（冰冻切片洗 2 次）
5. 透化：细胞用 0.3% Triton X-100，室温孵育 5min 透化；冰冻切片用 0.5% Triton X-100，5min；石蜡切片使用 20μg/ml 不含 DNA 酶的蛋白酶 k 处理，20-37℃作用 20-30min，不同组织的最佳温度和时间需摸索。
6. PBS 洗：弃透化液， PBS 洗 3 次，每次 5min。（可以多洗几次，必须把蛋白酶 K 洗干净，因为后面是用酶标记的，不洗干净会严重干扰后续标记反应） ◆ 如果 dUTP 是用生物素标记的，后面用 DAB 显色，那所有类型样品都要加内源性过氧化物酶封闭，用 PBS 配制 0.5%H₂O₂室温封闭 20min，封闭后再用 TdT 配套的 Buffer 配制的 0.05%BSA 室温封闭 10min。
7. TUNEL 反应：用 TdT 配套的 Buffer 配制的 TUNEL 检测液（含 200U/ml TdT）和 2-4μM dUTP 滴加到细胞爬片或组织切片样品上，37℃避光孵育 60min（如果是生物素标记的 dUTP 不用避光），注意防 TUNEL 检测液蒸发（可以将实验室常备的封口膜剪成合适大小的长条或圆片，覆盖在样品上，同时可以使 TUNEL 检测液均匀覆盖到样品；也可以用阻水笔圈出一个区域进行染色，反应在湿盒中进行）。
8. PBS 洗：弃反应液，PBS 洗 3 次，每次 5min，抗荧光淬灭封片剂封片。 ◆ 也可以用 DAPI 双染，有些细胞是不凋亡的，就只会被 DAPI 染色；凋亡的细胞会被 TUNEL 和 DAPI 染色。 ◆ 悬浮细胞或细胞悬液透化之后，用 PBS 洗 2 次，加入 50ul TUNEL 检测液，37℃避光孵育 60min，PBS 洗 2 次，再用 PBS 重悬后用流式细胞仪检测，或涂片后用荧光显微镜观察。
9. 荧光显微镜检测：观察和拍照。 FITC：激发光波长 450-500nm，发射波长 515-565nm。

TUNEL 染色检测细胞凋亡实验分组设计

• 有些试剂盒带有阳性对照，用阳性对照试剂处理细胞，正常细胞就会发生严重凋亡。
• 细胞转染或药物处理前，对细胞进行同步化，每个样本至少重复 3 次。

数据处理与绘图

• 定性分析：选典型视野拍照。
• 定量分析：每组多拍几个视野或全片扫描，计数总细胞数和凋亡细胞数，计算比例。将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。 ◆ 计总细胞数，如果是用荧光标记的，就做 DAPI 染色，把所有细胞的细胞核都染上；如果是用 DAB 显色的，可以用苏木精染细胞核。

Annexin V-PI 染色检测细胞凋亡的原理

• Annexin V-PI 法要素：Annexin V、PI、细胞膜不对称性破坏。 △ Annexin-V 是细胞膜内侧独有的磷脂酰丝氨酸的特异性染料，对磷脂酰丝氨酸有高度亲和性。 △ PI 不能通过活细胞膜，细胞凋亡时，细胞核内的核酸能被 PI 染色，所以能被 PI 染色标记的细胞就是凋亡得厉害的细胞。
• 正常细胞的细胞膜中，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜磷脂双分子层的内层。
• 凋亡细胞中，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜磷脂双分子层的外层。Annexin V 能以钙依赖的方式结合凋亡细胞膜外层的磷脂酰丝氨酸。
• 根据 Annexin V-PI 双染结果，可以判断细胞是否发生凋亡，以及凋亡程度如何。

Annexin V-PI 染色检测细胞凋亡的操作流程 （简化）

• 适用于检测培养的细胞（悬浮细胞、贴壁细胞），不适用于检测组织样本。

1. 制备细胞悬液：用不含 EDTA 的胰酶 37℃ 孵育消化细胞，制备细胞悬液， 2000rpm 离心 5min（为了下一步重悬容易点，离心速度可以减慢成 1500rpm，或离心时间可以缩短成 3min，看情况调整），弃上清。 ◆ 消化贴壁细胞注意： ① 培养上清中的细胞很可能是凋亡的细胞，也要收集，消化液中的细胞也要收集。 ② 所用的胰酶不能含有 EDTA，因为 EDTA 可以螯合钙离子，而 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸的结合是钙依赖的。
2. 洗 2 次：用 PBS 将细胞轻轻重悬洗一次，2000rpm 离心 5min，再用 1×binding buffer 重悬洗涤，2000rpm 离心 5min，弃上清。 ◆ 配制 1×binding buffer：Annexin V 通常会配一支 10×binding buffer，趁胰酶消化细胞时，用无菌去离子水稀释成 1×binding buffer（现配现用）。
3. 调整细胞浓度：使用 1×binding buffer 重悬细胞，将细胞浓度调整为 1-5×10⁶ /ml。（用细胞计数板计数后调整，60mm 的皿，细胞单层生长，长到 90%时大概可以得到 5×10⁶ 个细胞，具体看培养的细胞大小和培养密度）
4. Annexin V 染色 ：取 100ul 细胞悬液，加入 5ul 荧光标记的 Annexin V （按试剂说明书加染料），室温避光孵育 10-15min。
5. 洗： 1×binding buffer 洗一次，2000rpm 离心 5min，200μl 1×binding buffer 重悬细胞。
6. PI 染色：加入 5μl PI，混匀，PI 染色很快，加完就可以上机检测。
7. 流式测定。

• 试剂： PI, eBioscience 00-6990 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, eBioscience BMS500FI Annexin V Apoptosis Detection Kit APC, eBioscience 88-8007

Annexin V-PI 染色检测细胞凋亡实验分组设计

• 除了空白对照、阴性对照和实验组，还需要设置两管单染组。
• 最好再多加一组未染色的组，方便寻找目标细胞群。

数据处理与绘图

• 定量分析：使用专用软件分析流式数据（可以使用 FlowJo），得到凋亡细胞比例。将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。

• Annexin V/PI 染色检测细胞凋亡实验如何读图？

  • 正常细胞：Annexin V 阴性，PI 阴性；
  • 早期凋亡细胞：Annexin V 阳性（早期晚期都能检测到），PI 阴性（早期细胞膜还比较完整）；
  • 晚期凋亡细胞：Annexin V 阳性，PI 阳性；（双阳性）
  • 细胞碎片：Annexin V 阴性（膜没有了），PI 阳性。
  • Jurkat cells 白血病悬浮细胞
  • anti-Fas antibody 诱导细胞凋亡

• 细胞计数（细胞计数板）： 计数原则：压线细胞-数上不数下，数左不数右，如下图所示。 计算公式：4 个大方格中的细胞数 ÷ ÷ ÷ 4 × × × 稀释倍数 × × × 10⁴ = 细胞个数/ml ◆ 稀释倍数：例如，60mm的皿，细胞长到90%，消化成2ml细胞悬液，取100ul，稀释到1ml。