自1983年第一种转基因植物问世以来,只有20多年的时间,但植物基因工程的发展日新月异,硕果累累。将外源性基因人工引入天然植物,从遗传物质水平上有目的地改造植物,从而获得转基因植物,其性质将按照有利于人们需要的方向发生变化。植物基因工程具有得天独厚的优势是植物细胞的“全能性”理论。这是动物细胞无法比拟的。其次,植物基因工程不会像动物或人类基因工程那样遇到更多的社会、伦理和道德问题。植物基因工程为育种开辟了新的途径。
经过十多年的探索,基因转化技术日益成熟,形成了以农杆菌载体转化和基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。这两种转化系统机制明确,证据确凿,成功的例子最多,约占转基因植物的90%。
植物基因转化的受体:所谓基因转化受体,是指通过组织培养或其他非组织培养方式,高效稳定地再生无性系,接受外源DNA抗生素敏感再生系统的整合和转化。
虽然接受外源性基因的受体包括不同的形式,如叶片(合、胚胎愈合、愈合组织、悬浮细胞、原、悬浮细胞和原生质体,但其基本形式仍然是细胞。其中,叶片和农杆菌共同培养是最简单的转化方法;愈合组织转化效率高,生长速度快,是快速检测外源性基因表达的最佳受体;原生质体是单克隆转化的最佳材料。
植物基因转化的受体包括:
1.原生质体:原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样,转化的受体是单个独立的细胞,为选择遗传统一的转基因植物提供了可能性。
聚乙二醇是水稻广亲和品种02428的原生质(PEG)具有潮霉素的法导入B(HPT)卡那霉素抗性基因(KanR)以及昆虫荧光素酶基因(Luc)的质粒pTHL27DNA,在含有25μg/ml潮霉素B和100μg/ml卡那霉素培养基KPR和N连续培训处理6周,非转化敏感的原生细胞可以很好地去除;然后在无抗菌素选择压力的培养基中,转化细胞可再生植物(杨歧生等。,1996)。
2.悬浮细胞:以悬浮细胞为受体的转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电激法、显微注射法等。
使用小麦幼胚悬浮细胞JQ-700基因枪法转化,获得GUS最适合基因瞬间表达的参数。他们还建立了谷子幼穗悬浮培养细胞系和植物再生系统。胚性悬浮细胞系接种MS培养基,20d继代一次,直到绿芽出现;然后转化为无激素MS0或1/2MS培育基分化植物。用基因枪轰击转化悬浮细胞后,放置48h,检测GUS短表达频率TTF20%-40%;mg/L卡那霉素的MS在培养基上,5%-10%的愈伤组织具有抗性,并能稳定传代(董云洲等,1998)。
胚性愈伤组织:愈伤组织的转化方法也适用于胚性愈伤组织。玉米、甘蔗、芹菜等植物已成功转化胚性愈伤组织。芹菜胚性愈合组织使用根癌农杆菌C58C1(pBZ6111)感染后MS 2,4-D1mg/L十KT0.1mg/L培养基上继代培养。胭脂碱合成酶活性在筛选出的氯霉素抗性愈伤组织中检测到,表明外源性基因已融入芹菜细胞基因组并得到表达。抗性愈伤组织可在无激素的基本培养基上增殖,但分化出的再生植株畸形(郑世学等,1996)。
4、胚状体
胚状体由愈伤组织改造而成,其转化方法也与愈伤组织相同。
例如:使用根癌农杆菌LBA4404介绍番木瓜环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)与核酸酶(Nuclease)嵌合基因,通过振动共培养法转化番木瓜子叶型胚状体,筛选诱导再生转基因植物。NPTII分析和Southernblot分子杂交结果表明,PRSV-CP-Nuclease番木瓜核基因组(周鹏等,1995)已整合嵌合基因。
5.叶片:叶片(叶盘)是农杆菌转化的主要受体。在新鲜植物上取无菌幼叶,用打孔机或解剖刀切割直径3-5mm液体培养瓶中的叶片和农杆菌共培养20-30min,在此期间,农杆菌从切口轻轻摇动侵入叶片。然后在滤纸上吸干共培养的叶片,转移到非选择性培养基上培养3d,然后转移到含有卡那霉素或羧苯青霉素等抗生素的选择培养基上,诱导植物再生,从而获得遗传均匀性高的转基因植物。
叶盘法在双子叶植物的遗传转化中很常见。土豆东农303叶盘含有质粒pPZH1和辅助质粒pGV2260双元载体的根癌农杆菌菌株C58C1.在选择培训基础上进行转化培训30d叶盘切口形成抗性愈伤组织,转化率为4%-38%;NPTII酶活性分析及DNA转基因再生植物(王光清等)已被分子杂交证实,1994)。
6.其他受体:除叶片、愈伤组织、悬浮细胞或原生质体等常见受体外,还有多种不同类型的组织或器官可作为外源基因受体,如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等。
例如,将金鱼草下胚轴和根癌农杆菌切成小段形成一定伤口LBA4404(p35SGUSINT)共同培养,通过不定芽获得抗性G418再生植物,经过DNA/DNA斑点杂交及GUS组织检测活性原位,初步确认外源基因GUS金鱼草基因组已整合并表达(余迪求等,1996)。
赛思基因(www.scientsgene.com),注重基因转化技术的发展,致力于打破基因限制,进行基因编辑育种。