基因测序3-3、4代测序技术来势汹汹，国产化还在布局第二代测序？
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行业分析基因测序系列将重点关注基因测序设备，系统分析一代、二代、三代基因测序设备的技术原理，代表制造商、仪器特点和未来趋势。本文介绍了第三代和第四代测序技术及相应设备的特点和市场状况。同时，分析了基因测序设备的探索现状和技术趋势。
第二代测序方兴未艾，第三代和第四代测序来势汹汹。全球科研、产业甚至资本力量都专注于基因测序技术。
2014年，罗氏收购了纳米孔测序公司Genia Technologies， 2020年，罗氏宣布收购初创测序技术公司Stratos Genomics，为促进罗氏纳米孔测序仪的发展。罗氏在测序领域的探索和布局仍在继续。
而Illumina该公司还毫不犹豫地为其第四代基因测序技术进行。2018年11月，Illumina该计划以12亿美元的现金收购Pacific Biosciences，由于英国的竞争和市场管理局，当时引起了业界的广泛关注（CMA）多方博弈后，2020年1月2日宣布终止合并。
另一类非Sanger原理的DNA2008年，基于单个分子信号检测的测序技术成为现实DNA被称为单分子测序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS)。尽管从目前的进展来看，SMS它还没有完全实现预期的目标，但已经做出了许多重要的努力。包括这些新技术Helicos的tSMS，PacBio的SMRT等等。
Helicos Bioscience (MA, USA) 于2008年推出的HeliScope单分子测序平台被认为是第一个商业化的第三代测序仪。其测序原理tSMS斯坦福大学S. R. Quake等科学家提出。tSMS利用光学信号DNA碱基识别的边合成边测序 (sequencing by synthesis, SBS) 技术，HeliScope文库的制备相对简单。首先，待测DNA大约200次随机中断bp大小的片段，然后在3端加50bp带荧光标记的poly(A) tail。无需进行PCR扩展文库退火形成单链，固定在芯片上Oligo dT探针结合，利用poly(A)准确定位上荧光标记。接下来，依次加入4种Cy标有5荧光染料的单核苷酸DNA在聚合酶的作用下，与模板互补，延伸碱基，ICCD相机采集荧光信号。最后，去除荧光基团并通过化学剪切进行清洗，进行下一轮反应。原理如图所示。
tSMS原理
tSMS技术能够实现单分子测序，主要依赖于高分辨率的ICCD相机可以识别单个分子产生的荧光信号。然而，较弱的信号强度导致测序读长短，错误率高，尽管通过两次测序 (two-pass sequencing) 它可以降低错误率，但也可以增加测序成本和运行时间。
作为第三代测序仪的先驱HeliScope单分子测序平台正美国Helicos单分子测序真正实现了公司产品的出现。HeliScope两个芯片可以同时运行，平均读长约为35bp，一次运行的数据产量可达30Gb左右。测序仪的价格太高，大约是99.9万美元相当于第二代测序仪的两倍，运行成本相对较高，一个人类基因组的测序成本约为5万美元。2012年11月中旬，由于管理不善等原因， Helicos破产正式宣布。
实时单分子测序是Pacific Biosciences (CA, USA) 推出的专利技术。该方法用四色荧光标记dNTP和被称为零级波导 (zero-mode waveguides, ZMW) 单个纳米结构DNA分子进行测序。
这种ZMW直径为50-100纳米，深度为100nm孔纳米光电结构在二氧化硅基质金属铝薄层上形成微阵列，光进入ZMW然后呈指数级衰减，使孔内只有靠近基质的部分被照亮。Φ29 DNA聚合酶固定ZMW在底部，模板与引物结合，加入酶，然后加入四色荧光标记dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。
当DNA合成进行时，连接上dNTP由于在ZMW长时间停留在底部 (约200ms)，它的荧光信号可以区本底噪声区分开来识别。荧光基团连接在一起dNTP因此，在延伸下一个碱基时，上一个磷酸基团dNTP切除了荧光基团，保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT测序原理如图所示。
与tSMS同样，由于单分子荧光信号较弱，SMRT单碱基准确率仅为87.5%，但由于错误是随机产生的，通过多次测序和校正，在10×在这种情况下，9.9%。
到目前为止，PacBio公司基于SMRT测序技术推出了三种测序仪，第一种产品PacBio RS2011年正式发布和商业化；升级版于2013年4月发布PacBio RS Ⅱ；SMRT超长读长的优点之一，PacBio RS II测序平台能获得的最大读长为30Kb，平均读长约8.5Kb，是所有商品化测序仪中读长最长的。一个SMRT cell单次运行产生的数据量约为4000Mb，一天最多能产生6.4Gb的数据。
2015年10月，新升级的三代测序仪推出PacBio Sequel测序系统。Sequel与原来的1/3相比，系统变得更加灵巧，体积和重量只有1/3Illumina Hiseq体积也缩小了11%，但增加了SMRT Cell大大提高了数据输出，降低了测序成本。测序读长：平均测序读长10 ~ 18 kb，最长可超过60 kb；
PacBio公司仪器(左. Sequel；右. RS II）
据说中国已经成为2019年PacBio第三代单分子测序仪的装机量仅次于美国，达到120台。2017年，诺禾致源（Novogene）采购了10台Sequel全基因组测序系统，Iso-Seq以及靶向测序服务。希望中国的测序服务提供商能够组建一个小组（GrandOmics）于向PacBio采购了五台Sequel测序仪。2018年，深圳华大基因（BGI）BGI在拥有2台Sequel系统和一台PacBio RS II在测序仪的基础上，再次订购了10台Sequel测序仪。2018年底，中国科学院上海生命科学研究院2台Sequel单台测序仪价格3674500元。
纳米孔测序技术(又称第四代测序技术)是近年来兴起的新一代测序技术，不需要对吗？DNA?生物或化学处理，但基于物理原理进行测序，其简单原理是提取DNA事实上，单链一端与特殊蛋白质连接，并能控制序列进入速度。每个纳米孔结合核酸外切酶，孔内共价结合分子接头。单链DNA或RNA当分子通过纳米级孔时，由于碱基的形状和大小不同，孔内的电阻会发生变化。通过测量这些特征电流，可以识别通过小孔DNA分子上的碱基排列。同时因为DNA两个单链相互连接，这样DNA正义链和反义链可以通过纳米孔依次测序，组合成2D read，并且可以相互确认。测序原理见下图。
纳米孔测序技术原理
目前Oxford Nanopore基于纳米孔测序技术的测序平台包括MinION、GridION和PromethION。（如下图）
Oxford Nanopore公司测序平台(来自Oxford Nanopore和义广业整理公司官网)
MinION该系列测序仪以便携式、即时式为主，仪器单重仅为450克，尺寸比手机大不了多少，可在样品来源进行测序。数据流传输可以快速获得可操作的结果。单个流通池只能适用，但单个流通池中有50个 Gb的数据50 Gb数据生成短到超长（> 4 Mb）为了提供最终终实验的灵活性。官网称，可适用于整个基因组/外显子组、元基因组学、靶向测序、全转录组（cDNA）、较小的转录组(直接)RNA）多路复用以获得较小的样本。
GridION测序仪可安装1-5个流通池，紧凑型台式设备（尺寸：宽370毫米，高220毫米，深365毫米），集成计算功能，可灵活适用于实验室。纳米孔读取呈现给他们DNA或RNA长度-从短到超长(最长)> 4 Mb），多达250 Gb的数据* —可立即分析实时流式传输。与MinION整个转录组(直接)适用于更大的基因组或项目RNA或cDNA）或大量样品。
PromethION 24和PromethION 48测序平台最多运行24/48个可独立搜索的大容量PromethION每个流通池可以有50个流通池 Gb的数据。人类基因组的测序成本据说低于1000美元。适用于更大的基因组或项目、人口规模测序、高度重用的小基因组或目标区域或整个转录组(直接RNA或cDNA）。
虽然其技术具有巨大的领先优势，但业内大多数人对公司测序平台的测序准确性表示怀疑，认为MnION测序方法存在非随机的测序错误。比如MinION不能很好处理长于6个核苷酸的同聚物的测序，同时缺少碱基修饰检测的内参训练。据报道目前MinION测序仪的测序准确率在92％左右。对于类似致病菌和可变剪切的发掘，这样的测序准确率可以满足需求。但是对于临床检测，通常read准确率需要达到99.99％。因此，据称Oxford Nanopore公司正要在测序相关的化学反应和碱基识别软件方面进行优化。
2019年初，牛津纳米孔技术公司公布他们推出的PromethION 24和PromethION 48测序平台，最佳日读取数据量为7.6 Tb，理论上最大数据量为15 Tb。并宣布开放订购，仪器使用免费，但用户必须支付每年2万美元的服务合同费用。根据订单类型和数量，流量单元的价格从625美元到2000美元不等，每次运行的试剂成本为99美元。
全球TMT2020年2月3日讯，在获得中国公共健康专业人员的支持并与他们进行合作之后，Oxford Nanopore已经向中国发运了另外200台MinION测序仪以及相关耗材。
目前，Oxford Nanopore公司已选择在2021下半年在伦敦证券交易所IPO，目前分析师对它的估值在40-70亿英镑之间。
现今，国内不少医院着手建立服务核酸检测需求的院内实验室，这部分医院接下来或考虑采购基因测序仪。据2021年有关报道，现阶段国内医院市场存量基因测序仪仅800台左右，并平均每年按照约100台的新增数量增长。根据国家卫健委统计信息中心披露数据，截至2020年3月底，全国医疗卫生机构数有100.9万个，医院有3.4万家。医疗卫生机构显然构成了基因测序仪厂商尚未开发的蓝海市场。
但相较于国外巨头的全面布局，但国内基因测序企业仍困在技术瓶颈中，整体上依赖于巨头的技术平台。基因测序产业链中，我国企业主要集中在技术门槛较低的中下游基因测序服务领域。
目前基因测序设备国产化主要有三种方式：
1) 收购国外企业并自主研发的方式，如华大基因于2013 年收购美国 Complete Genomics 公司，获取 CG 公司基因测序设备知识产权，在此基础上进行自主研发；
2) 合作开发OEM的方式，如贝瑞和康、安诺优达分别和 Illumina 合作开发 的基因测序仪 NextSeq CN500、NextSeq 550AR，达安基因和博奥生物 则分别与 Thermo Fisher 合作的 DA8600、BioelectronSeq40 等。
3) 自主研发方式，如紫鑫药业同中科院合作开发的二代测序设备 BIGIS 系列产品，华因康开发的基因测序仪HYK-PSTAR-IIA，华大智造自主研发的全新便携式基因测序系统 DNBSEQ E系列等。
从表中可以看出，达安基因、博奥生物、贝瑞和康、安诺优达以及泛生子虽为国产医疗器械，实质却是贴牌合作开发并无核心技术。吉因加和华因康自主研发第二代测序仪，虽已取证，但在市场上并无亮眼表现。
华大的第二代测序仪技术是于2013年收购自美国Complete Genomics公司，称为cPAL，是一种边连接边测序（sequencing by ligation, SBL）的技术，类似solid技术平台，有着读长短的天然缺陷。后历时2年，华大自主开发了DNA纳米球技术（DNB），组合探针锚定连接（cPAL）等一系列核心测序技术，其测序原理利用四种不同颜色标记的探针去读取接头附近的碱基，探针能够与DNA片段结合，T4 DNA连接酶连接探针和anchor，使探针稳定结合，从该探针携带的荧光基团的颜色来判断该位置是何种碱基。当一轮反应结束后，去除anchor-prob产物，重复上一轮步骤测序下一个碱基。
自2015年起，华大先后发布 BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000 和 MGISEQ-200，这四款测序仪涵盖了高中低通量，并且都已经获得 NMPA 认证，不仅在科研领域开始大规模应用，在临床医学领域也开拓着越来越多的应用。
2018 年10月，华大智造发布全球最强日生产能力的 MGISEQ-T7，单日数据量高达 6Tb，每日可完成60例WGS。
2019 年1月6日，在美国加州China Focus@JPM Week上，华大智造首席运营官蒋慧博士宣布华大智造国产基因测序仪全球装机量突破 1000 台，已在全球 16个国家获得使用，累计产生的运行数据达20Pb。华大测序仪在全球基因测序行业发挥着越来越重要的作用。根据华大智造招股书显示，基因测序仪业务板块2020年营业收入为6.15亿元，测序仪销售323台。
齐碳科技在其官网上线了其首款产品QNome-9604正式发布的消息，同时发布的还有测序芯片 QCell-3841 和测序试剂盒 Qeagen-8。据称，可以达到 150k 以上的超长读长，8小时稳定产出500M，适用于微生物检测、扩增子测序等快速灵活的使用场景。
瀚海基因自主研发的第三代基因测序仪的研发进展停留在2017年的8月6日，公司对外的宣告：“由南方科技大学贺建奎团队自主研发的第三代基因测序仪在深圳诞生，目前已完成小批量样机生产”。
回顾基因测序的发展史，技术的迭代推动着测序市场的变化，前沿技术不断成为新的刚需，一家测序公司会因一个核心技术而崛起。
测序成本，读长和通量是评估测序技术先进与否的三个重要指标。
第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大幅提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。
第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。
第四代测序技术是真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程。虽然该方法具有检测速度快，成本低等特点，但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等造成的准确性的问题。
人们对于测序的最终期待是精准而又极低成本，从这个角度看测序技术还远未达到理想状态。国内外对于测序技术的研究还在继续，目前尚处于实验室阶段的技术，如固态纳米孔，电镜测序，蛋白质晶体管测序也同样值得期待。
【1】Harris TD, et al. Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome. Science 320: 106-109 (2008)
【2】Eid J, et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science 323: 133-138 (2009)
【3】PacBio官网
【4】Nanopore Sequencing: 20 Years Oncs, 2008, 9(1):387-402.
作者声明：感谢本文参考资料作者，文中观点仅供参考，不恰当之处还望包涵指正。
作者：俞利平