疫霉根和茎腐病是世界上一种破坏性的大豆土传病害。发现赋予病原体广谱抗性的基因是预防疾病的必要条件。在这里，我们发现大豆Rps11是一个具有27.7 kb 核苷酸结合点的重复基因对病原体具有广谱抗性。rps大豆中含有单一来源的大型大豆 NLR 基因簇基因组区域的来源是多轮重组，导致启动子融合和 LRR 扩展，这可能有助于广谱的抗性。NLR基因簇在具有系统发性的品种中，基因簇具有很强的结构多态性，并且在检查过的任何非Rps11供体品种中没有Rps11等位基因复制反映了 NLR 基因和 NLR 基因簇的创新进化。
赛思基因（www.scientsgene.com），注重基因转化技术的应用，致力于打破基因限制，帮助基因编辑育种。
期刊名称：nature communications
作者：Weidong Wang, Rajat Aggarwal & Jianxin Ma
单位：Purdue University, Corteva Agriscience
1、单独的Rps11基因座调节广谱抗性
我们最近在当地的大豆品种 PI594527 中，鉴定了一个Rps命名为基因座Rps11.它对12种病原体有抗性。基于来源 PI 594527 和易感品种 Williams 杂交对病原小种的反应，Rps11最初定位为染色体 7 8上的一个 348 kb 基因组区域。
为了消除可能的组装错误造成的初始阶段Rps我们对11映射结果中的潜在不准确性进行了注释和比较 PI 594527 整个基因组装 NLR 簇的 Rps11 区域和来自 Williams 82 基因组组装 v3.0 对应区域。来自 PI 594527的~648 kb Rps11区域由 12 个 NLR 基因（称为 R1-R12）组成（图 1a）。其中，R1、R4、R6、R7、R9、R11 和 R12 它是完整的，预计编码包含 2315-2463 大型氨基酸 NLR 蛋白；R2、R3、R5 和 R8 在他们的 3' 端丢失了 2 到 4 和R10携带第一个外显子 1.4 kb 插入。正如通过 RNA 测序（RNA-seq）只揭示 R1、R4、R6、R9 和 R12 在茎中表达(补充图) 4b）。Williams 82 组装 v.3.0 中约 522 kb 相应区域由 8 个 NLR 基因（称为 r1-r8）组成。在这些基因中，R8-r7 这似乎是两个基因组之间唯一的等位基因对(图 1a）。事实上，只有一小部分地区在这里 PI 594527 和 Williams 82 之间作为同线块共享，这仍然允许我们设计用于精细映射的标记（图 1a）。
Fig. 1: Map-based cloning of the Rps11 locus.
2.通过监测基因表达确定Rps11的候选基因
鉴于功能性 NLR 为了引导病原体无毒效应子的特异性识别和激活免疫反应，必须转化为蛋白质，作为细胞受体。我们监测了接种茎R5、R6、R7 和 R8 的表达与P. sojae小种 1 和 PI 594527 未接种的茎。只有四个基因 R6 在接种的茎和未接种的茎中表达，而 R5、R7 和 R8 在这些相同的样品中不表达，正如预期的那样， R表达对病原体有反应。因此，R6 是Rps11唯一可能的候选者它的存在可以通过它的表达来监测。这一结论得到了观察结果的进一步支持：所有检测到 R6 表达的重组体对病原菌有抵抗力，所有未检测到的重组体 R6 表达的重组体对小种 1 敏感（图 1c） . 总之，这些观察结果强烈表明 R6 确实是Rps它也在其他组织中表达(图) 1d）。
3、Rps通过遗传转化证明了11所赋予的抗性
进一步证明Rps我们开发了11个功能Rps对病原体的反应进行了互补测试。理想情况下，会Rps11基因组 DNA 转化为有自己启动子的大豆，最好揭示Rps11给予的抗性。然而，从从 TSR 到 TTS 的Rps11的大尺寸（27.7 kb），其启动子区在 TSR 上游边界不明确，以及在大豆中转换如此大片段的预期困难——这是最困难的片段之一，即使它很小 kb 12的 DNA 我们决定使用拟南芥的启动子泛素基因AtUbi3 (p AtUbi3 )，以驱动Rps11 CDS (CDS- Rps11 ) 表达(见方法)。p AtUbi 3::CDS- Rps11建筑被引入优秀的大豆品种 93Y21。p AtUbi 3::CDS- Rps11建筑被引入优秀的大豆品种 93Y21.正如预期的那样，有转基因T 2后代对这三个种族的抗性水平与作图群体的纯合RIL（Rps11 / Rps11 ）显示水平相似(图) 2a，b）。相比之下，非转基因(对照)对这些相同的种族敏感(图) 2a，b）。另外，正如预期的那样，在那些 T 在后代中检测到Rps11 -表达转基因(图) 2c），而且两个转化事件中每一个的表达水平都与抗性水平有关，如接种存活率所示。
Fig. 2: Complementation test results.
基于无间隙序列的精细定位和克隆方法分离了我们 Rps11，该Rps11赋予大豆对大豆假单胞菌的广谱抗性。鉴于 NLR 大豆泛基因组中基因簇的结构和基因拷贝数变化如此之大Rps基因座缺乏等位基因拷贝。许多研究多研究 NLR 植物病原体抗性的基础是基因结构和复制数的变化。在玉米中，发现赋予锈病抗性的Rp1基因座两侧有额外的基因座 NLR 基因是由许多不相等的基因间重组事件形成的，特别是在 LRR 在结构域中，它产生各种突变，其中一些可以改变种族电阻率。在高粱中发现真菌病原体被赋予Periconia circinate抗性的Pc一个基因座 NLR 基因，其两侧有额外的 NLR 该基因座的抗性通常通过侧翼 NLR 克服基因之间的定点重组。最近，对 26 测序了不同的玉米基因组，可以一窥rp1区域单倍变异。该区域表现出来rp1.基因组之间的复制数量发生了剧烈的变化，但这些基因组的一部分在该区域仍然存在差距，基因组rp1区域和许多其他区域 NLR 簇的结构和进化过程仍有待分析。
1.基因组装
使用Pacific BioSciences Sequel 平台生成长读数据。共测了八个 SMRT cell，原始子读数被过滤到最小 12 kb，产生 77 × 基因组覆盖。原始reads N50 长度为 28.9 kb。通过在 Illumina HiSeq2500 平台上以 PE测序150文库，生成短读长数据。文库的覆盖深度和平均分子长度分别为 45.2 × 和 93.8 kb。
在基因组图谱中Bionano Saphyr 在平台上生成的基因组图谱可以去除覆盖率和长度异常值。最终的基因组图谱组装由 43 基因组图谱由图谱组成 N50 为 26.7 Mb，图谱总长度为 985 Mb。
NLR基因注释和表达分析
NLR 基因使用 NLR-Annotator进行注释。使用 RNeasy Plant Mini Kit从每个关键重组体幼苗的混合茎组织中提取 RNA 样品，并用 RNase DNase Set处理以去除 DNA。使用 sra-toolkit v2.11.收集和提取公众 RNA-seq 数据。使用 STAR v2.7.9a将 RNA-seq 数据映射到供应系统的基因组，并根据映射到每个基因组 NLR 通过定量实时计算和表达基因的读取数 PCR 基因表达谱分析。
二、质粒结构与转化
为了构建Rps11候选基因R通过6的过表达构建，通过Genscript将R6的CDS通过同源重组将酵母合成三个片段AtUbi3启动子和Gateway ATT位点组装成Gateway进入载体。使用 Gateway Technology 和 Clonase II (25–0749, Invitrogen) 通过 attL-attR 重组反应将其重组为 Gateway 以转化为目的载体Ochrobactrum。灰杆菌属于介导的大豆胚轴转化。成熟大豆品种的氯气成熟 93Y21 消毒干种子，在室温下避光 5 g/L 蔗糖和 6 g/L 吸收琼脂半固体培养基。过夜孵化后，将种子室温下在黑暗中浸泡在蒸馏水中 3-4 小时。胚轴外植体分离完整，并用 15 mL 的Ochrobactrum haywardense转移到深板H1-8 悬浮液（600 nm 处的光密度 0.5）在由 1/10X Gamborg B5 基础培养基，30 g/L 蔗糖、20 mM MES、0.25 mg/L GA3、1.67 mg/L BAP、200 M 在乙酰丁香酮的感染培养基中， 和 1 mM 二硫苏糖醇 (pH 5.4)。这些板用封口膜(Parafilm M”VWR 目录号 52858)密封，然后超声处理（Sonicator-VWR 型号 50 T）30 秒。这些板用封口膜(Parafilm M”VWR 目录号 52858)密封，然后超声处理（Sonicator-VWR 型号 50 T）30 秒。超声处理后，将胚胎轴外植体转移到单层高压灭菌无菌滤纸上（VWR#415/目录号 28320-020）上。用 Micropore 胶带(目录号 1530-0, 3M, St. Paul, MN）密封板在暗光下(5)–10 E/m 2 /s，冷白荧光灯)下 21 °C 下孵育 16 小时3天。
共同培养后，将每个胚轴的基部部 30 g/L 蔗糖、6 g/L 琼脂和 25 mg/L 壮观霉素（S742，PhytoTech Labs）芽诱导培养基（R7100，PhytoTech Labs）作为可选试剂和 500 mg/L 头孢噻肟 (GoldBio, St. Louis, MO, USA)，pH 5.7。芽诱导在 26 °C下进行，光周期为 18 h，光强为 40-70 E/m 2 /s。在选择培养基中 4-6 周后，将抗壮观霉素的枝条切割并转移到含有 15 g/L 蔗糖、6 g/L 琼脂、10 mg/L 壮观霉素和250 mg/L 头孢噻肟用于进一步的枝条和根系伸长。
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